孫麗娜， 芮昌輝， 袁會(huì)珠

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部作物有害生物綜合治理綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

魚尼丁受體（RyR）是目前所知最大的鈣離子通道，由4個(gè)相同的亞基組成，每個(gè)亞基的分子量約為560ku。在脊椎動(dòng)物中存在3種亞型RyRs，而在昆蟲中僅存在一種魚尼丁受體［1]。二酰胺類化合物氟蟲雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺對(duì)鱗翅目害蟲具有較高的活性，其作用機(jī)制與其他類殺蟲劑不同，它們可以結(jié)合昆蟲體內(nèi)的魚尼丁受體，抑制昆蟲取食，引起蟲體收縮，使蟲體變粗變短，最終導(dǎo)致死亡［2－3]。自兩個(gè)化合物創(chuàng)制成功以來，不僅作用于魚尼丁受體化合物的合成備受關(guān)注，昆蟲魚尼丁受體的基因克隆及分子特性也因此成為焦點(diǎn)［4－5]。

小菜蛾［Plutella xylostella（L.）]是一種為害十字花科植物的世界性害蟲，也是對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的最嚴(yán)重害蟲之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，小菜蛾已經(jīng)對(duì)70多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，包括有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯類，以及昆蟲生長調(diào)節(jié)劑和蘇云金桿菌（Bt）等殺蟲劑［6]。盡管二酰胺類化合物對(duì)小菜蛾具有較高的活性，但是有研究稱小菜蛾對(duì)其抗性產(chǎn)生較快。田間監(jiān)測(cè)表明，在我國華南地區(qū)田間小菜蛾對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性與室內(nèi)敏感小菜蛾相比已達(dá)到100多倍［7]；而在泰國，2008年至2011年間，小菜蛾對(duì)氟蟲酰胺的抗性從1.5倍增至4 817倍，對(duì)氯蟲苯甲酰胺的抗性從35.4倍增至152倍［8]。因此克隆小菜蛾魚尼丁受體基因可以為今后小菜蛾抗性機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

小菜蛾于室內(nèi)采用無藥劑接觸甘藍(lán)苗連續(xù)飼養(yǎng)的技術(shù)飼養(yǎng)［9]。

1.2 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

取3齡小菜蛾幼蟲，用液氮研磨后，參照Trizol（Invitrogen）試劑說明書步驟提取總RNA。以反轉(zhuǎn)錄酶（PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa，大連，中國）合成cDNA第一鏈；利用TaKaRa 3′和5′RACE 試劑盒合成3′和5′RACE cDNA第一鏈。

1.3 引物設(shè)計(jì)

如圖1所示，小菜蛾RyR序列可以由18個(gè)片段重疊組合得到。本試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)根據(jù)美國國家生物工程信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫中家蠶B.m.（Bombyx mori）、煙芽夜蛾 H.v.（Heliothis virescens）、黑腹果蠅D.m.（Drosophila melanogaster）、桃蚜 M.p.（Myzus persicae）、棉蚜A.g.（Aphis gossypii）、玉米飛虱P.m.（Peregrinus maidis）、埃及伊蚊A.a（Aedes aegypti）這個(gè)7個(gè)物種魚尼丁受體基因氨基酸中保守序列來設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。根據(jù)簡(jiǎn)并引物的PCR測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)特異性引物，引物見表1。所有引物的合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

圖1 PCR擴(kuò)增和克隆小菜蛾魚尼丁受體（Px－RyR）cDNA片段示意圖

表1 克隆小菜蛾魚尼丁受體基因的引物1）

1.4 PCR擴(kuò)增

片段S1～S19的擴(kuò)增，按照TaKaRa Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行，按照不同的引物及擴(kuò)增片段的長度設(shè)置不同的PCR反應(yīng)程序。

cDNA 3′末端快速擴(kuò)增（3′RACE），outer PCR和inner PCR的反應(yīng)條件均為：94℃3min；94℃30s，65℃→50℃（－0.5℃／循環(huán)）30s，72℃1min，30個(gè)循環(huán)；94℃30s，50℃30s，72℃1min，15個(gè)循環(huán)，72℃10min。

cDNA 5′末端快速擴(kuò)增（5′RACE），outer PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。Inner PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，68℃1min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。

將目的片段克隆于pMD?19－T Simple Vector載體內(nèi)，選取陽性克隆測(cè)序。序列測(cè)定由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.5 序列測(cè)定及分析

利用DNAstar和Mega5.0等軟件進(jìn)行序列分析和比較。利用美國國家生物工程信息中心（NCBI，http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST／）的BLAST網(wǎng)絡(luò)工具與GenBank中的其他物種序列進(jìn)行比較，確定目標(biāo)產(chǎn)物的真實(shí)可靠性。分子量和等電點(diǎn)（molecular weight／isoelectric point）MW／pI在ExPaSy website（http：∥us.expasy.org／tools／pitool.htm）預(yù)測(cè)計(jì)算?？缒^(qū)域預(yù)測(cè)可以于www.cbs.dtu.dk／services／TMHMM 進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)二級(jí) 結(jié) 構(gòu) 于 http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov／Structure／cdd／wrpsb.cgi和http：∥www.expasy.org／tools／scanprosite／分析。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)NCBI中昆蟲魚尼丁受體基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過RT－PCR擴(kuò)增得到了目標(biāo)片段，而后根據(jù)目的片段序列，再設(shè)計(jì)特異性引物，繼續(xù)進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。進(jìn)一步進(jìn)行5′RACE和3′RACE擴(kuò)增，得到兩端序列后，通過小菜蛾所有片段的序列拼接得到小菜蛾魚尼丁受體基因cDNA序列全長。小菜蛾魚尼丁受體基因全長為15 748bp，其中5′端非閱讀區(qū)267bp，3′端非閱讀區(qū)109bp，開放閱讀區(qū)15 372bp。開放閱讀區(qū)編碼5 123個(gè)氨基酸殘基（GenBank登錄號(hào)為JF927788），預(yù)測(cè)其分子量約為579.39ku，等電點(diǎn)為5.45。

對(duì)預(yù)測(cè)的Px－RyR氨基酸序列與其他物種RyR基因氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明Px－RyR與其他物種RyR存在很高的同源性如表2。與煙芽夜蛾（H.v.）、家蠶（B.m.）、桃蚜（M.p.）、棉蚜（A.g.）、玉米飛虱（P.m.）、果蠅（D.m.）、鼠（M.m.）骨骼肌RyR1、鼠心肌RyR2及鼠RyR3的相似性分別為92%、92%，77%、77%、80%、78%、45%、47%、46%。

表2 Px－RyR與其他物種RyRs序列相似性 %

通過MEGA 5.0利用鄰接法對(duì)22個(gè)物種RyR蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)化樹分析（Bootsrap為1 000個(gè)重復(fù)），從而通過RyR氨基酸多態(tài)性來揭示這些物種間RyR蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系。由圖2看出，22個(gè)物種間的RyR基本分兩大類，即脊椎動(dòng)物中一類，無脊椎動(dòng)物中一類。圖2可以明顯看出，小菜蛾RyR與煙芽夜蛾和家蠶RyR關(guān)系最近。

圖2 Px－RyR與其他21個(gè)物種間RyR蛋白質(zhì)進(jìn)化樹分析

根據(jù)氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)小菜蛾魚尼丁受體基因存在6個(gè)跨膜區(qū)域，位于第4 474～5 022氨基酸之間。這6個(gè)氨基酸序列分別為（如表3）：Phe4474－Leu4496；Asp4655－Tyr4676；Val4734－Leu4756；Phe4875－Ala4897；Leu4923－Phe4945；Ile5003－Ile5022。除了跨膜區(qū)域外，小菜蛾魚尼丁受體蛋白還存在其他結(jié)構(gòu)域。如RyR結(jié)構(gòu)域（重復(fù)序列）、細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放通道結(jié)構(gòu)域、鈣離子結(jié)合的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域、MIR結(jié)構(gòu)域（因該結(jié)構(gòu)域同時(shí)存在于甘露糖轉(zhuǎn)移酶、三磷酸肌醇受體和魚尼丁受體中而命名）、Spla／RYanodine receptor SPRY結(jié)構(gòu)域、離子通道結(jié)構(gòu)域、魚尼丁受體和三磷酸肌醇受體相似結(jié)構(gòu)域、似SPRY結(jié)構(gòu)域及一些未命名的結(jié)構(gòu)域［10]。

表3 小菜蛾RyR跨膜區(qū)域序列

3 結(jié)論與討論

魚尼丁受體是最大的鈣離子釋放通道之一，在肌肉興奮收縮偶聯(lián)中具有重要作用，在很多細(xì)胞中具有第二信使的作用。魚尼丁受體因其所具有的特性，近30年來在醫(yī)學(xué)界備受關(guān)注，而近10年來在殺蟲劑研究領(lǐng)域也深受廣大研究者關(guān)注［1]。因此克隆昆蟲魚尼丁受體基因?qū)ψ饔糜隰~尼丁受體新化合物的設(shè)計(jì)及害蟲抗藥性研究至關(guān)重要。在本研究中，筆者克隆了小菜蛾魚尼丁受體。但其具有較大分子量，不易表達(dá)。

Puente等［11]克隆了編碼煙芽夜蛾RyR C－末端1 172個(gè)氨基酸，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與哺乳動(dòng)物3種亞型的RyRs具有45%～47%的同源性，與桃蚜（M.p.）、棉蚜（A.g.）、玉米飛虱（P.m.）、果蠅（D.m.）的同源性分別為76.8%、77.5%、79.6%、78.2%。而本文中小菜蛾RyR基因與其他物種同源性關(guān)系分析表明，小菜蛾RyR與煙芽夜蛾RyR和蠶相似性高達(dá)92%，這與3種昆蟲同屬鱗翅目有關(guān)。

根據(jù)預(yù)測(cè)的氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，小菜蛾魚尼丁受體基因C端存在6個(gè)跨膜區(qū)域，這也是魚尼丁受體基因的特性之一。有研究認(rèn)為魚尼丁受體基因存在6～8個(gè)跨膜區(qū)域，也有研究認(rèn)為存在4～12個(gè)跨膜區(qū)域［12－14]，然而魚尼丁受體基因跨膜區(qū)域的特定結(jié)構(gòu)尚未明確。Puente等［11]研究表明煙芽夜蛾C－末端存在5個(gè)較高的疏水性區(qū)域，這5個(gè)區(qū)域在氨基酸序列的位置為：516～532（M′）、704～720（M1）、782～798（M2）、972～988（M3）和1 054～1 070（M4），即為5個(gè)跨膜區(qū)域。煙芽夜蛾RyR與小菜蛾RyR跨膜區(qū)域的不同，可能是由于計(jì)算方式不同引起的。小菜蛾RyR基因6個(gè)跨膜區(qū)的親水性指數(shù)為1.5～2.6，然而TM4的親水性指數(shù)僅0.6，這與Zorzato等［14]推測(cè)的12個(gè)跨膜區(qū)域的親水性指數(shù)在0.8～2.9之間基本一致。

Puente等［11]研究還表明在煙芽夜蛾RyR跨膜區(qū)M3和M4之間存在一個(gè)鈣離子釋放通道的成孔結(jié)構(gòu)域GVRAGGGIGD，同樣的結(jié)構(gòu)域也存在于小菜蛾RyR基因C－末端的TM5和TM6之間。然而在兔心肌RyR中也存在這個(gè)結(jié)構(gòu)，但是GXRXGGG－XGD第8個(gè)氨基酸殘基I在兔心肌RyR中為第4897個(gè)氨基酸 T［15]。

此外，一個(gè)重復(fù)序列出現(xiàn)4次不僅體現(xiàn)在小菜蛾魚尼丁受體基因中，也存在于脊椎動(dòng)物的骨骼肌和心肌魚尼丁受體中［14－15]。第一個(gè)重復(fù)區(qū)域有94個(gè)殘基，位于859～952氨基酸之間；第二和第三個(gè)重復(fù)區(qū)域均有95個(gè)氨基酸殘基，位于972～1 066和2 838～2 932氨基酸之間；第四個(gè)重復(fù)區(qū)域有89個(gè)氨基酸，位于2 964～3 052氨基酸之間。比對(duì)重復(fù)序列（如圖3），根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，小菜蛾魚尼丁受體基因的重復(fù)序列是α－α型，而在RyR1和RyR2的重復(fù)序列呈現(xiàn)的是β－α－β－α型。在小菜蛾魚尼丁受體基因中4個(gè)重復(fù)序列的相似性有33%，在哺乳動(dòng)物RyR1和RyR2中重復(fù)序列的相似性為28%，然而這一區(qū)域的功能尚未得到驗(yàn)證。

微摩爾濃度的細(xì)胞質(zhì)Ca2＋可以激活RyRs，毫摩爾的Ca2＋可以抑制RyRs。這些雙向作用可能是由不同親和性的Ca2＋結(jié)合位點(diǎn)的相互作用引起。在鱗翅目昆蟲的RyRs中存在PPPEPTEEE氨基酸束，而在兔RyR1這也存在一個(gè)脯氨酸和谷氨酸豐富的氨基酸束PEPEPEPEPEPE（4 488～4 499）［16]。45Ca2＋的平衡結(jié)合試驗(yàn)表明龍蝦 RyR與哺乳動(dòng)物RyR1和RyR2的相應(yīng)此結(jié)構(gòu)域包含了Ca2＋鈍化RyR的結(jié)合位點(diǎn)即位于EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域鈣離子結(jié)合位點(diǎn)［17]。

圖3 重復(fù)序列比對(duì)結(jié)果圖

ATP與RyR1存在3個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列為GXGXXG［18]。在煙芽夜蛾的RyR中3個(gè)位點(diǎn)分別為GVGLEG、GEGGEG、GSGESG。而小菜蛾中僅有1個(gè)相似位點(diǎn)位于RyR的4 005～4 010（GVGLEG）。此外與煙芽夜蛾其余兩個(gè)位點(diǎn)的位置，小菜蛾的氨基酸序列分別為4 683～4 688（AEPGEG），4 710～4 715（GSGEE－）。在后兩個(gè)位點(diǎn)區(qū)域出現(xiàn)了一個(gè)突變位點(diǎn)，一個(gè)缺失位點(diǎn)，可能是由于物種間的差異造成，或者是ATP與小菜蛾RyR就存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

另一個(gè)對(duì)哺乳動(dòng)物RyRs具有重要調(diào)節(jié)作用的是具有雙向功能的鈣調(diào)蛋白。脫鈣鈣調(diào)蛋白（Ca2＋游離鈣調(diào)蛋白）激活的同時(shí)，鈣調(diào)蛋白（Ca2＋結(jié)合鈣調(diào)蛋白）抑制RyR鈣離子通道［19]。根據(jù)有關(guān)研究推斷4124HS RLWDAVGGFLFLFSHMQDKLSKH4148可能是鈣調(diào)蛋白與RyR的結(jié)合位點(diǎn)［11]。

Ulich等［20]認(rèn)為氟蟲雙酰胺與RyR的結(jié)合不受魚尼丁的影響，Kenta等［21]研究表明，氟蟲雙酰胺與鱗翅目昆蟲RyR的結(jié)合位點(diǎn)在C－末端4 111～5 084氨基酸之間，因此推測(cè)氟蟲雙酰胺與RyR的結(jié)合位點(diǎn)不同于魚尼丁的結(jié)合位點(diǎn)?？梢姡嘘P(guān)二酰胺類殺蟲劑的作用位點(diǎn)仍需進(jìn)一步研究。因此小菜蛾魚尼丁受體基因的克隆為此提供了有利的研究基礎(chǔ)，也為今后小菜蛾對(duì)二酰胺類化合物產(chǎn)生的抗性研究提供理論支持。

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