金 華 尚敏克 姜國斌

(大連民族學(xué)院，大連，116600)

楊樹是世界上分布最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種，也是優(yōu)良的水土保持植物［1］。通過基因工程技術(shù)對楊樹進(jìn)行抗逆性的遺傳改良受到世界各國學(xué)者和研究人員的普遍關(guān)注［2－3］。近年來，在楊樹基因工程研究中所涉及的外源基因主要包括用以清除活性氧的GSH基因［4］、液泡Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因At-NHX1［5］及甘露醇合成基因mtl－D［6］等，部分研究結(jié)果已證實(shí)，轉(zhuǎn)基因植株增強(qiáng)了對干旱、低溫或鹽漬等逆境脅迫耐性。當(dāng)然，在楊樹的遺傳轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)化成功與楊樹的基因型、外植體以及轉(zhuǎn)化條件等有很大關(guān)系［7－10］。

NDPK2基因主要編碼植物核苷二磷酸激酶2(NDPK2)。近年來的研究表明，NDPK2與促分裂原蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，結(jié)合 MAPK3和MAPK6［11］，進(jìn)而上調(diào) POD、CAT、硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶和過氧化物還原酶等多種抗氧化酶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)［12］。擬南芥核苷二磷酸激酶2基因(AtNDPK2)對大麥［13］、馬鈴薯［14］的遺傳轉(zhuǎn)化研究也表明，AtNDPK2基因的過量表達(dá)增強(qiáng)了作物對干旱或極端溫度的忍耐性。At-NDPK2基因?qū)ψ魑锏倪z傳轉(zhuǎn)化具有重要的實(shí)踐意義。但迄今為止，未見有關(guān)此基因在楊樹中轉(zhuǎn)化的報(bào)道。

轉(zhuǎn)雙抗蟲基因741楊是河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室和中國科學(xué)院合作，運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Bt殺蟲蛋白基因(BtCry1Ac)和慈菇蛋白酶抑制基因(AHPI)，即雙價(jià)抗蟲基因同時(shí)轉(zhuǎn)入優(yōu)良毛白楊無性系741楊獲得的轉(zhuǎn)雙抗蟲基因無性系［15］。本試驗(yàn)旨在以轉(zhuǎn)抗蟲基因741楊為試驗(yàn)材料，通過對轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化，建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，脅迫誘導(dǎo)型啟動子SWPA2調(diào)控的AtNDPK2基因?qū)朕D(zhuǎn)雙抗蟲基因741楊，以期獲得既抗蟲且抗非生物脅迫能力強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因楊樹新品系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試楊樹品種轉(zhuǎn)基因741楊，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)左永忠教授惠贈。繼代培養(yǎng)1個(gè)月的無菌苗葉片外植體，用于再生體系優(yōu)化及基因轉(zhuǎn)化的材料。根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105及質(zhì)粒pCAMBIA2300，均由韓國生命工學(xué)研究院環(huán)境生命工學(xué)研究中心提供。含有目的基因的重組質(zhì)粒載體，也由該中心構(gòu)建，包含脅迫誘導(dǎo)型啟動子SWPA2，并攜帶擬南芥核苷二磷酸激酶2(AtDNPK2)基因，篩選標(biāo)記為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hpt)。

1.2 外植體不定芽再生體系的優(yōu)化

選取生長良好、健壯的繼代培養(yǎng)試管苗，用解剖刀剪取葉片，在葉片一側(cè)垂直主脈剪1個(gè)傷口，然后將其接種于附加不同質(zhì)量濃度 6－BA(0.1、0.5、1.0、1.5 mg/L)和 IBA(0.05、0.10、0.20 mg/L)的 MS 培養(yǎng)基中，接種時(shí)葉正面朝上放置，下表皮與培養(yǎng)基接觸。

每種培養(yǎng)基接種40個(gè)葉片(4個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種10塊片)，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 500 lx，光照時(shí)間14 h/d。30 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)不定芽分化的情況。

1.3 根的誘導(dǎo)

將長至3～4 cm的不定芽的單芽切下，轉(zhuǎn)入未加任何激素的MS或1/2MS生根培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

選擇轉(zhuǎn)基因741楊生根誘導(dǎo)效果好的培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的IBA(0、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L)和 NAA(0、0.02、0.05、0.10、0.20 mg/L)，30 d后分別統(tǒng)計(jì)生根率。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶3個(gè)外植體。

1.4 影響轉(zhuǎn)化效率因素的確定

從平板上挑取單菌落，接種于含10 mL附加抗生素的YEP液體培養(yǎng)基(pH為7.2)中，在恒溫?fù)u床上，于28℃、180～200 r/min震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD6000.6～OD6000.8)。取1 mL菌液分別加至20 mL新鮮液體YEP培養(yǎng)基中(不含抗生素)繼續(xù)震蕩6 h左右，使OD600為0.5左右，作為工程菌侵染懸浮液。

共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)5 個(gè)梯度:2、3、4、5、6 d。菌液中與共培養(yǎng)培養(yǎng)基中的pH值為5.2、5.8，并加入 AS(200 μmol/L)。轉(zhuǎn)基因741楊中已攜帶卡那霉素篩選基因，因此，本試驗(yàn)所使用的質(zhì)粒以潮霉素為篩選標(biāo)記基因。潮霉素的質(zhì)量濃度設(shè)為 0、1、2、3、5、7、10、15 mg/L。本試驗(yàn)中每個(gè)處理選用100個(gè)外植體。試驗(yàn)重復(fù)3次，每次每個(gè)處理10皿，每個(gè)培養(yǎng)皿10個(gè)外植體。

1.5 PCR方法對轉(zhuǎn)基因毛白楊的檢測

采用CTAB法［16］提取5株轉(zhuǎn)基因植株的DNA，以pCAMBIA1300為陽性對照，以未轉(zhuǎn)化植株葉片的DNA為陰性對照。上游引物:5＇－ATTTATCGGCAAGGTGGAGGTT－3＇，下游引物:5＇－CCCGGTGAGGTGATTTGAA－3＇。反應(yīng)體系為:94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán);最后在72℃下繼續(xù)延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對不定芽的誘導(dǎo)

在芽和根形成的過程中，激素的濃度及配比起著關(guān)鍵的作用。本試驗(yàn)選用了6－BA和IBA進(jìn)行組合，誘導(dǎo)葉片不定芽的形成。

從表1 可看出:6－BA1.0 mg/L+IBA0.1 mg/L組合誘導(dǎo)不定芽效果最好，形成的不定芽數(shù)目多，分化率也高，達(dá)到了92.5%，而且不定芽生長健壯;6－BA 1.5 mg/L+IBA0.2 mg/L處理雖然不定芽分化最早，但不定芽數(shù)目和分化率都不如6－BA1.0 mg/L+IBA0.1 mg/L處理。因此，轉(zhuǎn)基因741楊葉片外植體最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基選為:MS+6－BA1.0 mg/L+IBA0.1 mg/L。

表1 不同激素對不定芽生成的影響

2.2 不同激素對生根的影響

將長至3～4 cm的不定芽單芽切下，轉(zhuǎn)入MS或1/2MS生根培養(yǎng)基中，30 d時(shí)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):1/2MS培養(yǎng)基生根誘導(dǎo)率達(dá)到了86.67%，并且主根數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)的主根數(shù)。無機(jī)離子減半的MS培養(yǎng)基有利用根的誘導(dǎo)，這與祁春芳等［17］的研究結(jié)果是一致的。

本試驗(yàn)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同質(zhì)量濃度的IBA或NAA進(jìn)行生根誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果表明:當(dāng)IBA的質(zhì)量濃度為0.05 mg/L時(shí)，生根誘導(dǎo)率為100%，并且根粗壯、次生根多。故選擇1/2MS附加0.05 mg/L的IBA為生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因741楊無菌苗的生根。

2.3 潮霉素質(zhì)量濃度的確定

篩選培養(yǎng)基潮霉素的質(zhì)量濃度設(shè)定為1、2、3、5、7、10、15 mg/L，3 周后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表 2。當(dāng)潮霉素的質(zhì)量濃度為3 mg/L時(shí)，葉片全部變黃，部分壞死且不能分化出芽。因此，認(rèn)為3 mg/L為合適的潮霉素篩選質(zhì)量濃度。

表2 不同質(zhì)量濃度的潮霉素對741毛白楊葉片分化的影響

2.4 共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響

最佳共培養(yǎng)時(shí)間確定的目的是既要保證外植體能與農(nóng)桿菌很好地共生，又要不使農(nóng)桿菌在后續(xù)培養(yǎng)中難于被抑制。試驗(yàn)結(jié)果表明，共培養(yǎng)2、3 d后進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，抗性愈傷組織誘導(dǎo)率并無顯著差異，均在28%左右。但在共培養(yǎng)4 d及長于4 d的情況下，農(nóng)桿菌會過度繁殖，導(dǎo)致外植體出現(xiàn)軟腐現(xiàn)象，從而失去再生出愈傷組織的能力。因此，選擇3 d為最佳共培養(yǎng)時(shí)間。

2.5 乙酰丁香酮的加入以及pH值對轉(zhuǎn)化的影響

本試驗(yàn)在農(nóng)桿菌菌液和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮并且調(diào)節(jié)了不同的pH值，研究其對轉(zhuǎn)化效果的影響。

從表3中可以看出，是否加入乙酰丁香酮(AS)，以及不同的pH值對潮霉素抗性芽誘導(dǎo)率有差異。其中處理C5(共培養(yǎng)培養(yǎng)基加入乙酰丁香酮、pH值調(diào)到5.2)誘導(dǎo)潮霉素抗性芽效果最顯著，這與文獻(xiàn)［9］的研究結(jié)果一致?？赡苡捎诠才囵B(yǎng)過程是Ti質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)T－DNA的轉(zhuǎn)化時(shí)期，在這個(gè)過程中加入乙酰丁香酮使與腫瘤形成有關(guān)的Vir區(qū)基因處于高度活化狀態(tài)，提高了Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化率。效果最不顯著的是處理C4，即在菌液中加入了乙酰丁香酮，并將共培養(yǎng)培養(yǎng)基調(diào)到pH=5.2。同時(shí)能看出，共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH=5.2時(shí)要比pH=5.8時(shí)潮霉素抗性芽的誘導(dǎo)率高。AS加在農(nóng)桿菌和外植體共培養(yǎng)的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率并不是最高，這可能是由于AS誘導(dǎo)劑劑量過大所致。

表3 不同pH值以及乙酰丁香酮對產(chǎn)生潮霉素抗性芽的影響

2.6 轉(zhuǎn)化和篩選

一個(gè)高效的組培再生系統(tǒng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系是植物基因工程成功的先決條件。文中采用優(yōu)化的741毛白楊無性系葉片最適再生轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為:不定芽篩選培養(yǎng)基為 MS+6－BA1.0 mg/L+IBA0.1 mg/L+Cef400 mg/L+Hyg3 mg/L;轉(zhuǎn)化生根植株培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.05 mg/L+Cef400 mg/L+Hyg5 mg/L。按此方法，轉(zhuǎn)基因741楊葉片不定芽轉(zhuǎn)化頻率可達(dá)40%，得到了抗潮霉素轉(zhuǎn)基因741楊無性系5株。

2.7 PCR 檢測

對所得5株潮霉素抗性轉(zhuǎn)基因741楊無性系均作PCR檢測，其中1株呈陽性反應(yīng)。PCR檢測結(jié)果見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)AtNDPK2基因741毛白楊基因組PCR檢測

電泳分析表明:在檢測的5株抗性植株中，有1個(gè)抗性植株經(jīng)過PCR擴(kuò)增后得到1條約為544 bp的片段，該片段大小與AtNDPK2基因大小基本一致，而未經(jīng)過轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)的組培苗植株基因組中沒有擴(kuò)增出對應(yīng)片段，因此，可以初步說明外源AtNDPK2基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因741楊基因組中。

3 結(jié)論與討論

本研究以轉(zhuǎn)雙抗蟲基因741楊的試管苗葉片為外植體，在 MS加入 1.0 mg/L 6－BA 和 0.1 mg/L IBA為不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以及1/2MS加入0.05 mg/L IBA為生根培養(yǎng)基，建立了高效快速的轉(zhuǎn)基因741楊組培再生體系。并利用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)法將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因741楊，獲得了再生植株。對影響轉(zhuǎn)基因741楊遺傳轉(zhuǎn)化因素進(jìn)行的研究結(jié)果表明:最佳共培養(yǎng)時(shí)間為3 d;潮霉素的最適篩選質(zhì)量濃度為3 mg/L;共培養(yǎng)培養(yǎng)基加入乙酰丁香酮、pH=5.2時(shí)，誘導(dǎo)抗性芽效果最為顯著。

成功的遺傳轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物再生系統(tǒng)的建立。鄭均寶［18］等以741楊的葉片為外植體，采用不同質(zhì)量濃度組合的BA和NAA對741楊的葉片再生體系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為6－BA3.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為 1/2MS+IBA0.3 mg/L;于學(xué)寧［19］建立的741楊的再生體系為:不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為6－BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為MS+IBA0.3 mg/L。本試驗(yàn)在誘導(dǎo)不定芽時(shí)用IBA代替了NAA，也得到了較高的誘導(dǎo)率，研究結(jié)果表明，未轉(zhuǎn)基因741楊與已轉(zhuǎn)雙抗蟲基因741楊在葉片離體再生方面并不存在太大的差異。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，pH值對抗性芽誘導(dǎo)影響也較大。Horford等［20］研究表明，AS的誘導(dǎo)效果與培養(yǎng)基的pH值有關(guān)，pH值為5.2時(shí)轉(zhuǎn)化效果最好。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基pH為5.8時(shí)，加入AS對轉(zhuǎn)化效果影響不顯著。而將pH值調(diào)至5.2后，加入AS可明顯地促進(jìn)轉(zhuǎn)基因741楊的遺傳轉(zhuǎn)化。這可能是培養(yǎng)基的pH值較低時(shí)有利于農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的活化，活化的Vir區(qū)基因易將目的基因?qū)肭锌谔幍募?xì)胞，從而提高了轉(zhuǎn)基因741楊的遺傳轉(zhuǎn)化效率。

由于轉(zhuǎn)基因741楊植株內(nèi)已含有抗卡那霉素篩選標(biāo)記基因NPT－II，所以本試驗(yàn)將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因連接T－DNA上作為篩選標(biāo)記基因。經(jīng)過含有潮霉素的培養(yǎng)基上的選擇并獲得的抗潮霉素再生植株，再經(jīng)過PCR檢測表現(xiàn)陽性者，初步確定為轉(zhuǎn)AtNDPK2基因的再生植株。這類植株正在擴(kuò)繁，準(zhǔn)備抗逆試驗(yàn)并栽培在試驗(yàn)地上對植株的形態(tài)學(xué)和經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行觀察，同時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步的分子生物學(xué)分析。

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