郭 震，李新鋒，戴力揚(yáng)

椎間盤退變的確切機(jī)理并不清楚，目前認(rèn)為是在遺傳易感性、衰老、力學(xué)負(fù)荷及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)障礙等因素共同作用下逐漸形成的［1］。隨著分子生物學(xué)及分子免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞因子、類激素等對(duì)椎間盤退變的作用逐漸被重視起來(lái)［2-3］。2007 年，Gruber等［4］發(fā)現(xiàn)人體椎間盤細(xì)胞表達(dá)瘦素;本研究組也發(fā)現(xiàn)人體椎間盤細(xì)胞表達(dá)瘦素及其受體，瘦素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞有增殖作用［5］。本研究采用HE 染色對(duì)比6 月齡的ob/ob 小鼠(瘦素缺乏小鼠)和野生型小鼠(C57BL)椎間盤形態(tài)學(xué);免疫組織化學(xué)檢測(cè)兩者椎間盤Ⅱ型膠原、蛋白聚糖表達(dá);定量PCR 檢測(cè)椎間盤Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原及蛋白聚糖基因表達(dá)等方面的差異，進(jìn)一步探討瘦素在活體小鼠椎間盤退變中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及其處理

雄性6 月齡野生型小鼠(C57BL 小鼠)及ob/ob小鼠(瘦素缺乏小鼠)各12 只(6 只做組織學(xué)測(cè)定，6只做分子生物學(xué)測(cè)量)，購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物中心。過量麻醉處死，分離腰椎(椎體及其椎間盤)。一部分立即放入多聚甲醛固定液中固定24 h，無(wú)菌蒸餾水沖洗后放入EDTA 中脫鈣2 周，經(jīng)不同梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片，以備HE 染色和免疫組化檢測(cè)用。另一部分標(biāo)本在顯微鏡下分離椎間盤后放入研缽中的Trizol 中并快速液氮冷凍、充分研磨，放置-80℃冰箱中以備RNA 提取。

1.2 方法

切片光鏡觀察HE 常規(guī)染色。

免疫組織化學(xué)染色 組織切片60℃烤箱過夜，然后脫蠟、不同梯度乙醇脫水、PBS 漂洗3 次后采用本研究組先前報(bào)道的方法［5］進(jìn)行免疫組化染色。具體方法為加入95℃、10 mmol/L 檸檬酸鹽緩沖液(pH=6)內(nèi)抗原修復(fù)10 min，室溫冷卻。1% H2O2室溫下處理15 min 消除內(nèi)源性過氧化物活性，室溫下5%正常山羊血清孵育30 min 以減少非特異性著色。在4℃用Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白聚糖(Abcom公司)兔多克隆抗體孵化12 h，徹底清洗(PBS 洗3 次，每次5 min)。加聚合物增強(qiáng)劑，常溫下孵育20 min，徹底清洗。加對(duì)應(yīng)的生物素化的羊抗鼠的IgG 聚合物，室溫孵育30 min。徹底清洗。滴加ABC 復(fù)合物室溫30 min，徹底清洗。DABH2O2顯色，而后蒸餾水洗凈，Gill 蘇木精復(fù)染逐級(jí)脫水和透明后封片、鏡檢。切片用Olympus BX50 圖片分析系統(tǒng)觀察。

Realtime PCR 實(shí)驗(yàn)方法按課題組先前報(bào)道的方法［6］。具體方法為冷凍于-80℃Trizol 中的標(biāo)本經(jīng)充分研磨后按說明書進(jìn)行RNA 提取;使用TaKa-Ra PrimescriptTM RT Reagent Kit (TaKaRa Japan)試劑盒配成10 μL 反應(yīng)體系，按說明書提示進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;Real-time PCR 引物設(shè)計(jì)經(jīng)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白聚糖基因基本信息，采用Oligo 4.0 軟件設(shè)計(jì)，由上海皓嘉生物公司合成目的基因及內(nèi)參基因(見表1)。Real-time PCR 反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq(Takara)試劑盒，按試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增，相關(guān)系數(shù)≥0.98。資料分析用RotorGene 6.0 分析軟件。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

顯微鏡檢查野生型小鼠的L4/L5椎間盤及其毗鄰的上下終板顯示纖維環(huán)、終板及髓核結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、有序;ob/ob小鼠的椎間盤結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，椎間盤高度降低，纖維環(huán)的外圍出現(xiàn)龜裂，局部甚至出現(xiàn)骨贅，失去了完整的椎間盤的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(見圖1)。

表1 Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白聚糖引物序列Tab.1 Primer sequences of collagen Ⅱ，collagen Ⅹand aggrecan in Real-time PCR

圖1 組織學(xué)分析Fig.1 Histologic findings

2.2 免疫組化觀察

免疫組化檢驗(yàn)顯示野生型小鼠的Ⅱ型膠原表達(dá)相對(duì)強(qiáng)烈，包括椎間盤纖維環(huán)的全層甚至髓核;而ob/ob 小鼠Ⅱ型膠原染色明顯減弱。蛋白聚糖免疫組化檢驗(yàn)顯示野生型小鼠的椎間盤上下終板染色明顯強(qiáng)烈，而ob/ob 小鼠椎間盤終板無(wú)論在鈣化區(qū)還是非鈣化區(qū)蛋白聚糖免疫著色都相對(duì)減弱(見圖2)。

2.3 Real-time PCR 檢測(cè)結(jié)果

Real-time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型小鼠，ob/ob 小鼠Ⅱ型膠原的mRNA 表達(dá)明顯下調(diào)，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ob/ob 小鼠蛋白聚糖的mRNA 表達(dá)量明顯下調(diào)，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ob/ob 小鼠椎間盤Ⅹ型膠原mRNA 的表達(dá)量明顯上調(diào)，兩者間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，見圖3)。

3 討 論

本研究的目的是評(píng)估瘦素對(duì)活體小鼠腰椎椎間盤退變的影響。研究結(jié)果提供的形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)及分子生物學(xué)的直接證據(jù)表明與野生型小鼠相比，ob/ob 小鼠椎間盤明顯退變，體內(nèi)瘦素缺乏可能加速小鼠椎間盤的退變。

圖2 免疫組化分析Fig.2 Immunostaining results

圖3 Real-time PCR 檢測(cè)Fig.3 Real-time PCR

實(shí)驗(yàn)中的ob/ob小鼠是野生型小鼠的基因突變小鼠，兩者的區(qū)別僅僅是前者基因突變導(dǎo)致瘦素缺乏，而無(wú)其他差異。盡管ob/ob 小鼠體重較大，但Griffin 等［7］發(fā)現(xiàn)瘦素缺乏型小鼠盡管體重是正常小鼠的近3 倍，然而其骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生率并未增加，此研究表明單純體重增加并不能增加關(guān)節(jié)軟骨退變。對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)(負(fù)重關(guān)節(jié))如此，對(duì)于椎間盤這種非負(fù)重關(guān)節(jié)，體重增加更不會(huì)對(duì)比較結(jié)果產(chǎn)生影響。6月齡小鼠處于中壯年時(shí)期，因此選擇對(duì)比觀察6 月齡野生型小鼠與ob/ob 小鼠的椎間盤退變的差異可以明確瘦素對(duì)小鼠椎間盤退變產(chǎn)生的可能影響。

眾所周知，椎間盤組織由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和水組成。而細(xì)胞外基質(zhì)主要由抵抗張力的膠原和抵抗壓力的蛋白多糖共同組成。腰椎椎間盤退變的病理生理基礎(chǔ)是椎間盤細(xì)胞基質(zhì)合成和分解代謝的失衡。Cs-Szabo 等［8］發(fā)現(xiàn)，椎間盤退變時(shí)，蛋白多糖及Ⅱ型膠原的基因表達(dá)均下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)觀察顯示野生型小鼠椎間盤盡管局部產(chǎn)生龜裂，但其纖維環(huán)、終板及髓核結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、有序;ob/ob 小鼠的椎間盤結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，椎間盤高度降低，纖維環(huán)出現(xiàn)龜裂、局部甚至出現(xiàn)骨贅，失去了完整的椎間盤的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。免疫組化及Real-time PCR 檢測(cè)顯示Ⅱ型膠原及蛋白多糖在椎間盤的退變中變化較為敏感，其含量對(duì)維持椎間盤的生物力學(xué)有重要影響［8-11］。免疫組化及Real-time PCR 檢測(cè)顯示，與野生型小鼠相比，ob/ob 小鼠的椎間盤Ⅱ型膠原、蛋白多糖的mRNA表達(dá)下調(diào)。從蛋白含量到基因表達(dá)都表明6月齡ob/ob 小鼠椎間盤退變明顯。

本實(shí)驗(yàn)形態(tài)學(xué)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)ob/ob 小鼠椎間盤局部甚至出現(xiàn)骨贅，于是繼續(xù)檢測(cè)了兩者Ⅹ型膠原的基因表達(dá)變化，因?yàn)棰湍z原在軟骨內(nèi)成骨及基質(zhì)鈣化中起重要作用，而且它反映了退變終末期的開始［12-13］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野生型小鼠Ⅹ型膠原稍有表達(dá)，而ob/ob 小鼠Ⅹ型膠原基因表達(dá)明顯上調(diào)，提示6 月齡ob/ob 小鼠椎間盤局部骨化增加，而異常的局部骨化可能進(jìn)一步影響小鼠椎間盤營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)，從而進(jìn)一步加重椎間盤的退變。

本研究組發(fā)現(xiàn)人體椎間盤細(xì)胞表達(dá)瘦素及其受體，瘦素對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠軟骨細(xì)胞有增殖作用［5］。眾所周知，成體生物細(xì)胞增殖的意義在于取代衰老死亡的細(xì)胞，維持個(gè)體細(xì)胞數(shù)量的相對(duì)平衡和機(jī)體的正常功能。機(jī)體的創(chuàng)傷愈合、組織再生、病理修復(fù)等都要依賴細(xì)胞增殖，所以生理狀態(tài)下、可控的細(xì)胞增殖是有益的。資料顯示軟骨細(xì)胞移植是治療椎間盤疾病的可選方式［14-15］，這也證實(shí)了細(xì)胞增殖的有益性。Murad 等［16］認(rèn)為瘦素是創(chuàng)傷愈合過程的自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)物。Boos 等［17］也發(fā)現(xiàn)椎間盤細(xì)胞的增殖可以對(duì)局部龜裂的椎間盤起到創(chuàng)傷修復(fù)的作用。本組研究人員認(rèn)為瘦素在活體小鼠椎間盤內(nèi)可能有利于創(chuàng)傷修復(fù)，從而延緩椎間盤退變;因此瘦素可以被認(rèn)作為防止椎間盤退變的潛在因素。

1994 年Zhang 等［18］發(fā)現(xiàn)并闡明ob 基因的蛋白產(chǎn)物瘦素的分子結(jié)構(gòu)及生理作用后，關(guān)于瘦素的研究不斷深入。Dumond 等［19］的研究證實(shí)瘦素在骨關(guān)節(jié)炎的病理生理中起重要作用，瘦素應(yīng)用后可刺激IGF-β 和TGF-β 2 種生長(zhǎng)因子的表達(dá)。近日Griffin等［7］發(fā)現(xiàn)瘦素缺乏型小鼠盡管體重是正常小鼠的近3 倍，然而其骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生率并未增加。以上文獻(xiàn)表明瘦素在四肢關(guān)節(jié)中可能加速了關(guān)節(jié)軟骨的退變。而Hamrick 等［20］研究表明瘦素缺乏在中軸骨及四肢骨、皮質(zhì)骨和小梁骨產(chǎn)生的效應(yīng)是不同的，瘦素缺乏在中軸骨可使椎體長(zhǎng)度增加、皮質(zhì)增厚、密度增高、小梁骨容量增大。本實(shí)驗(yàn)亦顯示瘦素缺乏加速了椎間盤軟骨的退變。對(duì)于瘦素在四肢關(guān)節(jié)及中軸關(guān)節(jié)軟骨的影響不同，考慮原因可能是椎間盤和關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源不同。關(guān)節(jié)軟骨營(yíng)養(yǎng)主要來(lái)自正?；杭败浌莾?nèi)緣和最深層的鄰近的血管;椎間盤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)則主要依靠穿過軟骨下板、呈血管袢樣終止于終板骨軟骨界面的毛細(xì)血管網(wǎng)。

椎體骺板是位于椎體上下兩端的軟骨終板，隨著骨骼發(fā)育成熟，骺板逐漸退化為透明軟骨板，并通過鈣化的軟骨和椎體骨質(zhì)接合，是椎間盤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)的主要途徑，與椎間盤源性疾病密切相關(guān)［21］。在腰椎椎間盤退變的諸多危險(xiǎn)因素中，營(yíng)養(yǎng)障礙等后天因素對(duì)椎間盤退變的發(fā)病起著非常重要的作用［22］。近期Rutges 等［23］研究發(fā)現(xiàn)軟骨下骨在椎間盤退變之前已出現(xiàn)明顯退變?？梢娗罢咄俗冎潞笳郀I(yíng)養(yǎng)因素變化而加速后者退變。因此本研究認(rèn)為瘦素可能同時(shí)因影響椎體骨質(zhì)代謝，從而進(jìn)一步影響椎間盤的代謝，這也是本課題組進(jìn)一步研究的方向。

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