包素珍 張愛琴 孫在典 宋 紅 李恒楠

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022；3.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)黃芪建中湯可減輕放化療后的毒副反應(yīng)，有明顯的抗氧化作用，抑制組織中表皮生長(zhǎng)因子及表皮生長(zhǎng)因子受體的過度表達(dá)進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生［1］。cyclin D1為目前公認(rèn)的癌基因，其過度表達(dá)時(shí)使細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換時(shí)間縮短，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，從而發(fā)生癌變。為進(jìn)一步明確黃芪建中湯對(duì)免疫功能的影響及抑制腫瘤發(fā)生的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過建立脾氣虛Lewis肺癌模型，研究黃芪建中湯對(duì)脾氣虛肺癌小鼠免疫功能及cyclin D1基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與瘤株 C57BL/6小鼠60只，雌性，體質(zhì)量（20±2）g，購于上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房。小鼠Lewis肺癌瘤株，購于上海醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物 黃芪建中湯由芍藥18 g，桂枝9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大棗4枚，飴糖30 g，黃芪9 g組成。藥材購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部中藥房，按《中藥藥理研究方法學(xué)》計(jì)算小鼠低、中、高劑量的等效劑量分別為：8.1、16.2、32.4 g/kg體質(zhì)量，分別為成人劑量的6、12、24倍，按常規(guī)方法煎成湯劑，配制成生藥含量分別為 0.324、0.648、1.296 g/mL 的藥液。

1.3 試劑及儀器 D-木糖試劑盒，南京建成生物工程研究所；胃泌素放免試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所；白細(xì)胞介素（IL）-2 ELISAKIT試劑盒，上海晶美生物工程有限公司；cyclin D1引物，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；UV2000紫外分光光度計(jì)，美國UNICO公司；2400型PCR儀，英國TECHNE公司產(chǎn)品；GIS-2008凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；UR-4100型酶標(biāo)儀，美國Dynaech公司。

1.4 造模方法 用C57小鼠60只常規(guī)飼養(yǎng)2 d適應(yīng)環(huán)境后，取20只小鼠正常飼養(yǎng)，其余40只小鼠采用苦寒瀉下法造脾氣虛模型（以100 g大黃∶600 mL蒸餾水的比例，于50℃水浴中浸泡8 h，可得大黃浸泡液400 mL。每只小鼠每日灌胃1 mL，連續(xù)9 d。從第5日起，小鼠表現(xiàn)為便溏、納少、倦臥、懶動(dòng)、消瘦、拱背、精神萎糜等癥狀。第10日分別測(cè)正常組和模型對(duì)照組各10只小鼠血清木糖濃度及胃泌素水平，驗(yàn)證脾氣虛模型成功。脾氣虛模型建成后，正常組取10只和模型對(duì)照組40只小鼠接種腫瘤：在無菌條件下取接種14 d的新鮮無壞死Lewis癌塊組織，制成單細(xì)胞懸液，0.9%氯化鈉注射液調(diào)整濃度至6×106個(gè)/mL，取0.2 mL癌細(xì)胞原液，接種于小鼠的左腋下皮下。從取出腫瘤到移植完最后1只小鼠時(shí)間控制在2 h之內(nèi)。

1.5 分組與給藥 C57BL小鼠接種24 h后，隨機(jī)分為6組，每組10只。正常組、腫瘤對(duì)照組、模型對(duì)照組給以灌胃0.9%氯化鈉注射液0.5 mL，每日1次，黃芪建中湯低、中、高劑量組分別給以低、中、高的黃芪建中湯0.5 mL灌胃，每日1次。連續(xù)14 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測(cè) 觀察小鼠的體質(zhì)量、飲食、行動(dòng)、精神食欲、行動(dòng)狀態(tài)、毛色、皮毛的光澤度等全身情況。給藥結(jié)束后第2日稱體質(zhì)量，眼球后取血，檢測(cè)血清木糖濃度及血清胃泌素水平；脫頸椎處死小鼠，無菌剝?nèi)×鰤K，保存于液氮中，RT-PCR法檢測(cè)cyclin D1的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用（±s）表示，計(jì)量資料兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用one-way方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 脾氣虛Lewis肺癌小鼠模型建立 見表1。從建立脾氣虛模型第5日起，小鼠表現(xiàn)為便溏、納少、倦臥、懶動(dòng)、消瘦、拱背、精神萎靡等癥狀。造模第10日球后取血，檢測(cè)血清木糖濃度及胃泌素含量均低于正常，與正常組比較，差異非常顯著 （P＜0.01）（見表1）。同時(shí)在小鼠左腋下接種Lewis肺癌瘤株，小鼠于接種后第7～10日腋下出現(xiàn)大小不等的腫塊，以模型對(duì)照組較明顯；第15日處死小鼠，取血檢測(cè)血清木糖濃度及胃泌素水平驗(yàn)證脾氣虛模型仍存在，提示小鼠脾氣虛Lewis肺癌模型復(fù)制成功。

表1 不同組別小鼠血清血清木糖、胃泌素水平比較（±s）

表1 不同組別小鼠血清血清木糖、胃泌素水平比較（±s）

與正常組比較，**P＜0.01。

組 別 n 血清木糖（mmol/L） 血清胃泌素（pg/mL）正常組 10 3.21±0.32 33.56±3.51模型對(duì)照組 10 2.09±0.24** 27.14±0.19**

2.2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較 見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黃芪建中湯各劑量組瘤質(zhì)量均減輕，與模型對(duì)照組比較，差異顯著（P＜0.05），以高劑量組抑瘤效果最佳（P＜0.01）。

2.3 各組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)比較 見表3。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：黃芪建中湯中、高劑量組脾指數(shù)、胸腺指數(shù)增加顯著，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01）。

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

表2 各組小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率比較（±s）

與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 n 瘤質(zhì)量（g） 抑瘤率（%）腫瘤對(duì)照組 10 3.72±0.47 -模型對(duì)照組 10 3.82±0.83 -黃芪建中湯低劑量組 10 3.32±0.46* 13.09黃芪建中湯中劑量組 10 2.98±0.24* 21.99黃芪建中湯高劑量組 10 2.34±0.34** 38.74

表2 各組小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)比較（±s）

表2 各組小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)比較（±s）

組 別 n 脾指數(shù)（mg/g） 胸腺指數(shù)（mg/g）正常組 10 18.14±1.38 2.89±0.35腫瘤對(duì)照組 10 13.24±1.94 1.96±0.70模型對(duì)照組 10 12.31±0.79 1.75±0.45黃芪建中湯低劑量組 10 14.50±3.16 2.01±0.29黃芪建中湯中劑量組 10 15.31±2.59* 2.32±0.53*黃芪建中湯高劑量組 10 17.28±2.85** 2.54±0.60**

2.4 各組小鼠腫瘤組織中cyclin D1-mRNA/GAPDH的基因表達(dá)比較 見表4，圖1。黃芪建中湯中、高劑量組cyclin D1-mRNA/GAPDH表達(dá)下降，以高劑量組最為顯著，與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表4 各組小鼠腫瘤組織cyclin D1-mRNA/GAPDH表達(dá)比較（±s）

表4 各組小鼠腫瘤組織cyclin D1-mRNA/GAPDH表達(dá)比較（±s）

組 別 n cyclin D1/GAPDH腫瘤對(duì)照組 10 0.73±0.09模型對(duì)照組 10 0.96±0.15黃芪建中湯低劑量組 10 0.95±0.24黃芪建中湯中劑量組 10 0.66±0.17黃芪建中湯高劑量組 10 0.62±0.11**

圖1 各組cyclin D1基因、GAPDH基因表達(dá)

3 討 論

cyclin D1是G1期細(xì)胞周期素，主要作用是促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S檢查點(diǎn)，cyclin D1對(duì)細(xì)胞周期G1期的調(diào)控是通過對(duì)抑癌基因蛋白pRb的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。pRb通過信號(hào)傳遞促進(jìn)cyclin D1基因表達(dá)［2］。G1/S調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞周期中最重要的調(diào)控點(diǎn)，決定細(xì)胞周期的時(shí)間。cyclin D1過度表達(dá)是導(dǎo)致G1/S期檢測(cè)點(diǎn)缺陷主要原因。檢測(cè)點(diǎn)功能缺陷可能會(huì)導(dǎo)致遺傳基因突變和染色體結(jié)構(gòu)異常的細(xì)胞獲得增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［3］。腫瘤是一種細(xì)胞周期性疾病，cyclin D1作為細(xì)胞周期重要的正調(diào)控因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用［4-6］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“脾為后天之本，氣血生化之源”，有防御外邪侵害并自我恢復(fù)的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，其和機(jī)體免疫功能有著密切的聯(lián)系。如李艷等［7］對(duì)ConA、LPS誘導(dǎo)T、B淋巴增殖反應(yīng)，可使大黃煎液建立的脾虛小鼠不同程度地提高其體液免疫功能。杜雅薇等［8］研究發(fā)現(xiàn)中藥組可不同程度提高大黃致脾虛泄瀉的SIgA、IL-2。而IL-2是最主要、最強(qiáng)有力的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，并且可誘導(dǎo)或促進(jìn)多種細(xì)胞毒細(xì)胞活性，如自然殺傷細(xì)胞（NK）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞（LAK）細(xì)胞，這些細(xì)胞在機(jī)體的免疫監(jiān)視免疫方面至關(guān)重要。王紅偉等［9］發(fā)現(xiàn)脾虛機(jī)體的紅細(xì)胞C3b-受體花環(huán)率（C3b-RR）和T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯降低，而Ic-RR明顯升高，提示紅細(xì)胞介導(dǎo)的消除循環(huán)免疫復(fù)合物及免疫黏附功能下降，從而導(dǎo)致脾虛時(shí)免疫功能的低下，淋巴細(xì)胞亞群比例的失調(diào)，這在脾虛型惡性腫瘤患者中的表現(xiàn)較為明顯。

肺癌病位在肺，病機(jī)為陰陽不和，病本為正氣不足。癌著于身，易走竄耗傷氣血所致惡病質(zhì)居多。在中醫(yī)范圍內(nèi)又屬虛勞范疇。黃芪建中湯出自《金匱要略·血痹虛勞》“虛勞里急，諸不足，黃芪建中湯主之”，藥用黃芪、桂枝、芍藥、炙甘草、生姜、大棗、飴糖組成，功能在于燮理陰陽，培補(bǔ)脾氣，使谷氣充足，正氣旺盛。本實(shí)驗(yàn)提示黃芪建中湯組均有升高脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的作用，并降低cyclin D1/GAPDH水平。黃芪建中湯抑制腫瘤的機(jī)理之一可能是改善脾氣虛肺癌小鼠的免疫功能、下調(diào)腫瘤組織cyclin D1-mRNA的表達(dá)。

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