王鳳羽，馬林先，李聰敏，張 華，豐慧根

1)河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院;河南省人口缺陷干預(yù)技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州450002 2)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)系新鄉(xiāng)453000

染色體非整倍體即染色體數(shù)目異常，發(fā)生于生殖細(xì)胞則可能導(dǎo)致不育不孕、自發(fā)流產(chǎn)和先天出生缺陷，其中21、18、13、X和Y等染色體非整倍體最為常見，在早期自然流產(chǎn)中，非整倍體率高達(dá)50%，存活新生兒發(fā)生該病的幾率為1/150～1/120，約占新生兒染色體異常的95%。目前，染色體異常治療困難，療效不滿意，因此，快速準(zhǔn)確地對(duì)染色體非整倍體異常做出產(chǎn)前診斷，對(duì)降低出生缺陷率，提高人口質(zhì)量意義重大。多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)是2002年由荷蘭的Schouten等［1］設(shè)計(jì)發(fā)明，僅需50～200 ng DNA，便能通過分子雜交、連接和PCR技術(shù)對(duì)40多個(gè)不同的待測(cè)核酸靶序列進(jìn)行定性和半定量分析。根據(jù)其快速、特異、靈敏及高效的特點(diǎn)，近幾年已開始應(yīng)用于染色體畸變?cè)\斷。該研究運(yùn)用MLPA技術(shù)對(duì)200例羊水進(jìn)行檢測(cè)，通過與傳統(tǒng)核型分析得出的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，探討其在非整倍體異常及產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 標(biāo)本來自2010年10月至2011年8月河南省人口和計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究院產(chǎn)前診斷就診的孕婦，孕婦懷孕18～22周時(shí)，在臨床醫(yī)師告知下，選擇羊水穿刺診斷200例。羊水標(biāo)本2 mL用于MLPA檢測(cè)，3～5 mL用于染色體培養(yǎng)。

1.2MLPA 方法

1.2.1 基因組DNA提取 取羊水2 mL，13 000 r/min離心5 min，盡量移走上清液，加入10～15 g/L蛋白酶K，55℃消化30 min，取此細(xì)胞裂解液0.5 mL進(jìn)行DNA提取，并進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)。

1.2.2 MLPA檢測(cè) 采用MLPA非整倍體檢測(cè)試劑盒(SALSA MLPA P095，荷蘭MRC公司)，該試劑盒包括36條探針，其中13、18、21和X染色體上分別有8條，另4條位于Y染色體，可檢測(cè)這5種染色體拷貝數(shù)的變化。①DNA變性多重探針雜交:取待測(cè)DNA 100 ng置于PCR管中，加TE緩沖液至5 μL，于PCR儀上98℃變性5 min，快速降溫，25℃維持。取出PCR管，加入多重探針及MLPA緩沖液各1.5 μL，充分混勻后，95 ℃變性 1 min，60 ℃雜交16 h，54℃維持。②多重探針連接:在上述PCR管內(nèi)加入連接酶1 μL及連接酶緩沖液A、B各3 μL，再加入純水配成40 μL反應(yīng)體系后，54℃反應(yīng)15 min，隨后98℃ 5 min滅活連接酶。③多重PCR反應(yīng):取上述連接產(chǎn)物 10 μL，分別加入 4 μL SALSA PCR 緩沖液、26 μL純水，配成40 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)。72℃延伸20 min，15℃維持。

1.2.3 毛細(xì)管電泳檢測(cè) 取2 μL PCR產(chǎn)物，分別加入32 μL 上樣緩沖液、0.3 μL DNA 標(biāo)記物混勻，采用遺傳分析儀(BECKMAN CEQ 8800)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳并采集數(shù)據(jù)。

1.2.4 MLPA產(chǎn)物分析及結(jié)果判定 將CEQ系統(tǒng)分析后的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為Excel格式，所得數(shù)據(jù)通過Coffalyser v9.4軟件(Holland-MRC公司)進(jìn)行分析，得出基因相對(duì)拷貝數(shù)比值。比值為～0.3，表示該探針檢測(cè)的片段純合子缺失;比值為～0.7，表示該探針?biāo)鶛z測(cè)基因片段存在雜合缺失;比值為～1.3，表示該基因片段無缺失;比值＞1.3表示該檢測(cè)區(qū)域存在重復(fù)片段。

1.3 羊水染色體模型分析 按常規(guī)步驟進(jìn)行［2］。

2 結(jié)果

2.1 MLPA檢測(cè)結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果比較

見表1。200例羊水標(biāo)本MLPA均成功檢測(cè)，檢出率為100%。2個(gè)工作日完成檢測(cè)的有190例，占95%;需重復(fù)檢測(cè)的有10例，占5%。其中，1例因羊水污染，細(xì)胞培養(yǎng)失敗，無法應(yīng)用傳統(tǒng)染色體核型分析，經(jīng)MLPA檢測(cè)結(jié)果顯示正常;其余199例樣本與傳統(tǒng)染色體核型分析方法得出結(jié)論一致。

2.2 毛細(xì)管電泳異常圖譜 見圖1。女性MLPA電泳圖譜峰型共8組，每組有4個(gè)峰，依次來自21、18、13和X染色體。男性MLPA電泳圖譜峰型共8組，前4組每組有5個(gè)峰，依次來自21、18、13、X和Y染色體，后4組每組有4個(gè)峰，依次來自21、18、13和X染色體。

表1 200例羊水MLPA和染色體培養(yǎng)核型分析結(jié)果

圖1 MLPA電泳圖譜

3 討論

染色體異常是引起人類出生缺陷的主要原因，我國(guó)每年有相當(dāng)數(shù)量的21三體和其他染色體異?；純撼錾?，給家庭和社會(huì)造成很大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，在臨床中應(yīng)用的篩查21三體征的方法是酶聯(lián)免疫法。該方法通過檢測(cè)孕婦外周血中妊娠相關(guān)血漿蛋白、甲胎蛋白、人絨毛膜促性腺激素濃度值，再結(jié)合孕齡和孕周計(jì)算其危險(xiǎn)系數(shù)。因?yàn)闇y(cè)定值特異性不高，對(duì)于高危孕婦仍需要其他方法確診［2］。細(xì)胞分裂中期G顯帶或高分辨染色體核型分析結(jié)果可靠，一直是染色體異常診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但羊水染色體核型分析需體外培養(yǎng)，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)人員技術(shù)要求高，一旦培養(yǎng)失敗或可供分析的分裂相少時(shí)，都無法進(jìn)行分析。間期熒光原位雜交(FISH)不需培養(yǎng)細(xì)胞，但要找到特異性強(qiáng)的探針方可獲得高效雜交，且每個(gè)樣本需計(jì)數(shù)分析數(shù)十個(gè)細(xì)胞核，無法高通量檢測(cè)，成本較高，不適于在臨床普及［3］。熒光定量PCR(FQPCR)耗時(shí)短(24～48 h)，但必須設(shè)計(jì)多對(duì)引物進(jìn)行多位點(diǎn)擴(kuò)增才能避免假陰性的結(jié)論，目前為止尚無這樣高雜合度的商品化試劑盒出現(xiàn)。

近年來，MLPA技術(shù)備受關(guān)注，已開始應(yīng)用于染色體畸變?cè)\斷。Slater等［4］2003年用MLPA進(jìn)行了13、18、21、X和Y的非整倍性診斷。此后，國(guó)外學(xué)者［5-8］進(jìn)一步對(duì)染色體核型分析與MLPA技術(shù)做了比較，確定了MLPA可以作為獨(dú)立快速診斷染色體非整倍體的方法。國(guó)內(nèi)學(xué)者［9-11］同樣做了相關(guān)研究，認(rèn)為MLPA技術(shù)可應(yīng)用于常見染色體非整倍體畸變的快速檢測(cè)。作者用該技術(shù)對(duì)200例羊水樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)成功率為100%，2個(gè)工作日完成的占95%，需重復(fù)檢測(cè)的占5%，與上述有關(guān)報(bào)道一致。除1例因羊水污染，細(xì)胞培養(yǎng)失敗，無法應(yīng)用傳統(tǒng)染色體核型分析外，其余199例樣本與傳統(tǒng)染色體核型分析方法得出結(jié)論一致。傳統(tǒng)染色體核型分析失敗的1例經(jīng)MLPA檢測(cè)結(jié)果顯示正常，證實(shí)MLPA技術(shù)在羊水染色體非整倍體異常診斷及產(chǎn)前診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

唐少華等［10］的研究結(jié)果表明，MLPA技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)染色體結(jié)構(gòu)異常。羅世強(qiáng)等［11］研究結(jié)果顯示，MLPA技術(shù)對(duì)21三體嵌合體未能做出明確判斷。對(duì)于非整倍體鑲嵌體的診斷，各位學(xué)者［4-13］觀點(diǎn)不同:有的認(rèn)為MLPA、FISH和FQ-PCR技術(shù)一樣檢測(cè)的是非培養(yǎng)細(xì)胞，因此不能用于鑲嵌體檢測(cè);也有人認(rèn)為建立探針比值合適區(qū)間就可以辨別鑲嵌體，然后進(jìn)一步確診。

該研究中需重復(fù)實(shí)驗(yàn)的10例，可能是由于DNA不足、變性不完全或鹽離子濃度過高造成。用新鮮羊水標(biāo)本提高DNA質(zhì)量，延長(zhǎng)變性時(shí)間使變性更充分，用去離子水洗脫DNA降低離子濃度，對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和耗材嚴(yán)格消毒等手段可以增加實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和成功率。另外，作者發(fā)現(xiàn)分析數(shù)據(jù)中存在個(gè)別染色體比值范圍多低于設(shè)定范圍，可能是受實(shí)驗(yàn)室條件影響，有待于進(jìn)一步分析。

當(dāng)今社會(huì)，由于孕婦年齡普遍較高造成高危孕婦相對(duì)增多，為減少其等待的焦慮，迫切需要一種快速、簡(jiǎn)便、可靠的方法及時(shí)對(duì)其做出診斷。MLPA是基于基因水平的診斷新技術(shù)，具有很好的特異性和使用價(jià)值，該技術(shù)有望應(yīng)用于染色體非整倍體檢測(cè)。

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