王 欣，馬汝逸，張文娟，韓寧娟，楊麗嘉，張廣政#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室鄭州450001 2)鄭州市第六人民醫(yī)院口腔科鄭州4500003)鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州450001

脊髓損傷是一種嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量的致殘性損傷，在法醫(yī)實(shí)踐及臨床中都比較常見。有研究［1］表明誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)在正常健康的脊髓組織檢測不到，但在病理狀態(tài)下，被脊髓內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子及內(nèi)毒素誘導(dǎo)而表達(dá)，生成大量一氧化氮(NO)，過量的NO可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。該實(shí)驗(yàn)通過改良的Allen’s法建立脊髓損傷模型，觀察大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中iNOS以及細(xì)胞凋亡的變化，探討其與脊髓損傷時(shí)間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 成年健康SD大鼠54只，雌雄不限，體質(zhì)量250～300 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分為對(duì)照組(6只)和實(shí)驗(yàn)組(48只)。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)傷后時(shí)間分為 3 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d 組，每組6 只。

1.2 動(dòng)物模型的建立 按改良的Allen’s法制作大鼠脊髓損傷模型。實(shí)驗(yàn)組大鼠用100 g/L的水合氯醛腹腔注射，注射劑量0.04 mL/kg，麻醉成功后，將其俯臥固定于手術(shù)臺(tái)上，行背中段正中切口，切除T10～12錐板，暴露硬脊膜，用20 g砝碼順直玻管自10 cm處自由墜落(砝碼與脊髓之間放一與暴露脊髓面積相當(dāng)?shù)淖灾茐|片)，造成大鼠脊髓中度損傷，損傷瞬間可見大鼠出現(xiàn)后肢突然伸直的脊髓反射。對(duì)照組只進(jìn)行椎板切除，不做打擊即縫合。實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后后肢活動(dòng)及排尿功能障礙，需每天早晚按摩大鼠膀胱2次，排空膀胱。

1.3 大鼠脊髓組織HE染色、灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)iNOS的免疫組織化學(xué)檢測及細(xì)胞凋亡檢測 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死前先麻醉，后用40 g/L多聚甲醛液快速心臟滴注20 min，心臟灌流后逐層剝開脊髓，取出損傷段約5 mm，多聚甲醛固定24 h后，石蠟包埋，5 μm厚切片，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色、iNOS免疫組織化學(xué)染色和原位末端標(biāo)記(TUNEL)。均用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，兔抗大鼠iNOS多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒均購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，TUNEL試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司。高倍視野下，每張切片在脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)部位分別選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)iNOS陽性細(xì)胞(胞質(zhì)可見棕黃色顆粒)，求均值;每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞(凋亡細(xì)胞胞核呈明顯的棕黃色)，計(jì)算凋亡指數(shù)，即陽性細(xì)胞百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 10.0處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)比較大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間iNOS陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 脊髓組織病理學(xué)變化 對(duì)照組未見明顯改變。實(shí)驗(yàn)組損傷早期(3 h～3 d)脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)可見出血點(diǎn);神經(jīng)元腫脹，體積增大，核膜不清，周圍出現(xiàn)空隙;毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞附壁。損傷后3 d可見脊髓組織疏松;神經(jīng)元周圍出現(xiàn)較多空隙，神經(jīng)元數(shù)量減少，膠質(zhì)細(xì)胞增生;損傷血管周圍可見大量淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞聚集。14 d后組織損傷處灰白質(zhì)分界漸清，水腫及出血消失，有炎細(xì)胞浸潤，纖維組織增生(圖1)。

2.2 大鼠脊髓損傷后iNOS陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞凋亡情況 見圖2、3，表1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組損傷后不同時(shí)間組織病理學(xué)變化(HE)

表1 大鼠脊髓損傷后不同時(shí)間iNOS陽性細(xì)胞數(shù)和凋亡指數(shù)的變化(n=6)

3 討論

NO參與很多疾病的發(fā)病過程，但檢測比較困難［2］。NOS是NO合成的關(guān)鍵酶，其中iNOS的活性最大且作用時(shí)間最長，正常生理情況下幾乎不表達(dá)，但是當(dāng)機(jī)體受到外界干擾時(shí)，如外傷、炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病等，iNOS 將大量表達(dá)［3］。有實(shí)驗(yàn)［4］表明脊髓前角內(nèi)NOS的活性升高產(chǎn)生一定量的NO，能促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢功能改善。胡培高等［5］的研究也表明，脊髓損傷后NOS表達(dá)的適當(dāng)升高對(duì)脊髓繼發(fā)性損傷應(yīng)該有保護(hù)作用，而大量的NO生成則會(huì)加快凋亡細(xì)胞的生成，造成不可逆的功能障礙。

該研究結(jié)果顯示脊髓損傷后3 h，脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中iNOS陽性細(xì)胞開始增多，1 d后脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中陽性細(xì)胞均多見，3 d時(shí)脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，達(dá)到高峰，持續(xù)到傷后7 d，14 d后陽性細(xì)胞減少。各實(shí)驗(yàn)組脊髓灰質(zhì)內(nèi)iNOS陽性細(xì)胞明顯多于白質(zhì)，并且多為較大的神經(jīng)元細(xì)胞，陽性特征明顯，這為脊髓損傷定位提供了參考。脊髓損傷12 h后脊髓細(xì)胞開始以凋亡方式死亡，主要集中于損傷部位，脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)中均可見凋亡細(xì)胞，主要為膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)元凋亡少見，至損傷后7 d達(dá)高峰，高峰期白質(zhì)脫髓鞘的部位有大量凋亡細(xì)胞，提示膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡在脊髓損傷的病理生理過程中占主要作用。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，脊髓損傷后iNOS陽性細(xì)胞的變化與凋亡細(xì)胞的變化基本一致，隨著iNOS陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，凋亡細(xì)胞也在損傷后7 d達(dá)到高峰，隨后都有所下降，這也進(jìn)一步證實(shí)了iNOS介導(dǎo)生成的NO在細(xì)胞凋亡中起著關(guān)鍵作用［6］。二者都是脊髓損傷后反映損傷時(shí)間的敏感指標(biāo)，其變化呈現(xiàn)一定的時(shí)序性，因此有可能作為法醫(yī)學(xué)中判斷脊髓損傷時(shí)間的新指標(biāo);同時(shí)也可能為脊髓損傷患者的診斷與治療提供理論參考。

［1］Nishio E，F(xiàn)ukushima K，Shiozaki M，et al.Nitric oxide donor SNAP induces apoptosis in smooth muscle cells through cGMP-independent mechanism［J］.Biochem Biophys Res Commun，1996，221(1):163

［2］王煒煜，秦啟生.一氧化氮合成酶及其在腦損傷研究中的法醫(yī)學(xué)意義［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2003，18(3):188

［3］周志軍.缺氧腦組織與一氧化氮及其合酶［J］.中國臨床康復(fù)，2005，9(17):170

［4］劉曾旭，劉德明，王文敏，等.復(fù)方丹參對(duì)脊髓損傷大鼠一氧化氮合酶神經(jīng)元的影響［J］.解剖學(xué)雜志，2004，27(4):401

［5］胡培高，孔抗美，王新家，等.復(fù)方丹參和甲基強(qiáng)的松龍聯(lián)合治療對(duì)大鼠急性損傷脊髓細(xì)胞凋亡及NOS表達(dá)的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，21(17):1873

［6］Satake K，Matsuyama Y，Kamiya M，et al.Nitric oxide via macrophage iNOS induces apoptosis following traumatic spinal cord injury［J］.Brain Res Mol Brain Res，2000，85(1/2):114