陳登宇 陳峻崧 王 凈 曹文虎 張洪義 楊翠萍 張云霞 竇 駿

(東南大學醫(yī)學院病原生物學與免疫學系，南京 210009)

上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer，EOC)約占卵巢癌的90%，是女性生殖器常見腫瘤，因腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移使患者五年生存期低［1］。鋅指增強子結(jié)合蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)參與卵巢癌細胞生長轉(zhuǎn)移和癌干細胞(Cancer stem cells，CSCs)表型的維持，成為靶向治療 EOC 及 CSCs 的靶點［2，3］。本研究以 pSUPEREGFP1質(zhì)粒為載體，構建靶向ZEB1的shRNA重組干擾質(zhì)粒shZEB1，轉(zhuǎn)染至人卵巢癌SKOV3細胞，G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，檢測其抑制ZEB1表達的效率，進行功能性實驗判定ZEB1下調(diào)后對上皮性卵巢癌細胞生物學性狀如克隆形成能力、遷移力、裸鼠體內(nèi)致瘤能力的影響，探討ZEB1作為分子靶點用于卵巢癌靶向治療的價值。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑 人卵巢癌細胞株SKOV3，購自上海細胞所;ZEB1單克隆抗體，Santa cruz公司;BALB/c雌性裸鼠，揚州大學動物實驗中心;RT-PCR試劑盒，北京天根生化科技有限公司;質(zhì)粒小提及割膠純化試劑盒，Axygen公司;限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅡ及EcoRⅠ，大連寶生物公司;T4多聚核苷酸激酶、T4 DNA連接酶，大連寶生物公司;脂質(zhì)體2000，Invitrogen公司;G418，Sigma公司;Trizol試劑，Invitrogen公司。

1．2 RT-PCR檢測 SKOV3細胞中 ZEB1、miR-200c表達情況 引物設計參照GeneBank中人ZEB1、U6及β-actin序列，應用 Primer Premier5．0軟件，于基因不同外顯子上設計引物;miR-200c根據(jù)成熟體設計RT特異引物和PCR引物。SKOV3細胞抽提總RNA，RT-PCR擴增ZEB1，并半定量PCR擴增miR-200c，以U6作為內(nèi)參，Quantity One軟件進行灰度分析判定miR-200c表達量，見表1。

1．3 重組質(zhì)粒的構建鑒定及轉(zhuǎn)染 設計與合成靶向ZEB1基因的 siRNA，針對人 ZEB1編碼基因ZEB1的cDNA序列(GenBank NM001128128)，根據(jù)pSUPER-EGFP1載體要求設計合成shRNA寡核苷酸模板，利用Dharmacon和Invitrogen公司的在線設計軟件尋找候選ZEB1的RNAi靶點序列，由上海英駿生物技術有限公司合成。單鏈兩端包含保護堿基和BglⅡ和HindⅢ 酶切殘基。scramble-siRNA序列質(zhì)粒為不靶向任何基因的陰性對照序列。ZEB1-siRNA序列正義鏈:5'-GATCCCCAGGAAGAGGAGGAGGATAATTCAAGAGATTATCCTCCTCCTCTTCCTTTTTTGGAAA-3';反義鏈:5'-AGCTTTTCCAAAA AAGGAAGAGGAGGAGGATAATCTCTTGAATTATCC TCCTCCTCTTCCTGGG-3'。scramble-siRNA序列正義鏈:5'-GATCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCA AGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAA-3';反義鏈:5'-AGCTTTTCCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAAGG G-3'。siRNA寡核苷酸鏈退火，雙酶切質(zhì)粒pSUPEREGFP1，將磷酸化 ZEB1-siRNA和回收質(zhì)粒片段pSUPER-EGFP1質(zhì)粒進行連接反應，4℃過夜，轉(zhuǎn)化新鮮感受態(tài)細菌，挑取克隆提取質(zhì)粒，構建質(zhì)粒pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA(簡稱 shZEB1)，雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SKOV3細胞后有限稀釋法及G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株;同法構建和轉(zhuǎn)染pSUPEREGFP1-scramble-shRNA(簡稱 sramble)質(zhì)粒［4］。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小一覽表Tab．1 Primer sequence and product size

1．4 Western blot檢測ZEB1蛋白表達 取野生型SKOV3及轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒SKOV3細胞各5×105，RIPA裂解液裂解細胞，離心后取上清獲細胞裂解蛋白，Bradford蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，再按常規(guī)方法行 Western blot檢測。

1．5 平板克隆形成試驗 制備細胞懸液，按每板500個細胞接種于培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%［5］。

1．6 劃痕試驗 將待觀測細胞種于6孔板中，待生長融合成片后進行檢測。用無菌槍頭在孔中劃線，使劃線處無細胞生長;0、24、72小時，分別在顯微鏡相同位置下觀察劃線無細胞處的寬度，拍照記錄。分析計算:愈合度=(1－某時點劃痕寬度/原始劃痕寬度)×100%，判定細胞遷移能力。

1．7 裸鼠致瘤試驗 分別取5×106/100μl sh-ZEB1-SKOV3和scramble-SKOV3細胞懸液，背部皮下注射4～6周齡BALB/c雌性裸鼠，每組4只，監(jiān)測各組小鼠腫瘤生長情況。致瘤腫塊分離后，由蘇木素伊紅HE染色光鏡下觀察其病理形態(tài)。

1．8 統(tǒng)計學分析 t檢驗，P＜0．05有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 SKOV3細胞中ZEB1-mRNA表達 SKOV3細胞經(jīng)總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄至cDNA并擴增ZEB1后，所得產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用AL2000 DNA maker作為分子量標志，電泳結(jié)果顯示，SKOV3細胞中存在ZEB1基因的表達(圖1A)。

2．2 重組質(zhì)粒酶切鑒定 pSUPER-EGFP1-ZEB1-shRNA、pSUPER-EGFP1-scramble-shRNA 與 pSU-PER-EGFP1空質(zhì)粒，分別經(jīng)HindⅢ、EcoRⅠ雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示(圖1B)，pSUPER-EGFP1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，其片段約在237 bp處，構建質(zhì)粒酶切產(chǎn)物片段約在291 bp處，均符合設計片段大小，表明shZEB1和scramble質(zhì)粒構建成功，且進一步測序證實。

圖1 shZEB1質(zhì)粒構建及穩(wěn)轉(zhuǎn)SKOV3細胞株篩選Fig．1 shZEB1 p lasm id construction and screening stable transfection SKOV3 cells

2．3 陽性克隆篩選 以含800μg/ml G418初步篩選轉(zhuǎn)染成功的細胞，隨后在熒光顯微鏡下找出表達綠色熒光蛋白的陽性轉(zhuǎn)染細胞克隆，以有限稀釋法篩選得到陽性單個細胞克隆(圖1C)，隨后擴大培養(yǎng)獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

2．4 SKOV3細胞中ZEB1蛋白表達 用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞提取總蛋白經(jīng) Western blot檢測ZEB1蛋白表達水平。結(jié)果顯示(圖1D)，與野生型 SKOV3細胞相比，轉(zhuǎn)染pSUPER-EGFP1-scramble質(zhì)粒SKOV3細胞ZEB1蛋白表達與野生型基本相同，而轉(zhuǎn)染sh-ZEB1質(zhì)粒組細胞ZEB1蛋白表達顯著下降。

2．5 平板克隆檢測 培養(yǎng)10天，培養(yǎng)板中出現(xiàn)肉眼可見的克隆，終止培養(yǎng)后用吉姆薩染色，計數(shù)克隆形成率，shZEB1組較scramble組SKOV3細胞中克隆形成率降低，P ＜0．05(圖2)。

2．6 細胞遷移力檢測 0、24、72小時分別在顯微鏡相同位置下觀察劃線無細胞處豎線寬度，拍照記錄后再行各無細胞區(qū)域?qū)挾缺容^，判斷愈合度。由圖3A～D可見，shZEB1組較scramble組及野生型組SKOV3細胞中愈合度降低，經(jīng)統(tǒng)計分析差異有顯著性，P＜0．05。該結(jié)果顯示，ZEB1低表達時 SKOV3細胞遷移力降低。

圖2 平板克隆形成率Fig．2 Plate colony formation ratios

圖3 劃痕試驗Fig．3 W ound healing assay

圖4 半定量RT-PCR檢測m iR-200c表達Fig．4 m iR-200c detected by sem i-quantitative RT-PCR

圖5 體內(nèi)不同SKOV3細胞裸鼠致瘤能力比較Fig．5 Comparison of the tumorigenicity of the different SKOV3 cells in the nudemice

圖6 不同轉(zhuǎn)染SKOV3對裸鼠致瘤腫塊病理切片(HE染色，×400)Fig．6 Pathological section of different transfection SKOV3 tumor in nudemice(HE staining，×400)

2．7 miR-200c檢測 RT-PCR檢測miR-200c的表達(圖4)，半定量RT-PCR分析shZEB1組較scramble組SKOV3細胞中miR-200c表達量增加，而miR-200c表達量增加會引起 SKOV3細胞遷移力降低［6］。

2．8 體內(nèi)細胞致瘤能力比較 5周后觀察不同轉(zhuǎn)染組SKOV3細胞裸鼠致瘤情況，致瘤率比較結(jié)果顯示shZEB1組較scramble組致瘤性下降(圖5)。大體觀察shZEB1 SKOV3腫塊體積較小，生長緩慢;而scramble SKOV3腫塊生長較快體積大，邊緣粘連包膜不清，病理切片(圖6)HE染色見腫塊中明顯核異質(zhì)癌細胞，增生活躍，細胞核呈紫藍色，細胞漿呈紅色，細胞核漿比例增大，細胞核呈卵圓或不規(guī)則形，見有核仁。

3 討論

EOC約占卵巢癌的90%，是女性常見腫瘤，其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位，但因腫瘤易轉(zhuǎn)移復發(fā)，導致病死率占各類婦科腫瘤的首位［1］。因此，探明卵巢癌發(fā)生的起因，針對病因進行有針對性治療，尤其抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移清除CSCs才能從根本上治愈卵巢癌。ZEB1蛋白參與卵巢癌細胞生長轉(zhuǎn)移和CSCs表型的維持，成為靶向治療EOC及CSCs有價值的靶點，對于根治 EOC 及 CSCs具有重要意義［2，3］。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)可與特異性mRNA結(jié)合導致靶基因的降解，進而導致目的基因表達下調(diào)。利用載體在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成shRNA，是目前RNAi技術運用的主要手段，載體大多選用自身攜帶的RNA依賴性聚合酶Ⅲ的啟動子，如U6或H1等啟動shRNA編碼序列，穩(wěn)定持續(xù)地表達shRNA，經(jīng)Dicer酶切產(chǎn)生siRNA，特異性地降解靶mRNA，使RNAi發(fā)揮作用時間更長、更穩(wěn)定，從而達到有效抑制靶基因表達的目的［7］。本實驗所選用的pSUPER-EGFP1質(zhì)粒以新霉素抗性基因作為篩選標記，且在巨細胞病毒啟動子CMV的驅(qū)動下可表達增強型綠色熒光蛋白EGFP，受紫外光源激發(fā)即可發(fā)出綠色熒光，可檢測轉(zhuǎn)染效率，以利選取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單細胞克隆。為準確有效抑制靶基因表達，我們首先針對靶基因ZEB1編碼基因mRNA鏈，參考相應文獻及siRNA設計規(guī)則、評分標準，選取有效靶向ZEB1 mRNA的siRNA鏈，經(jīng)BLAST比對證實其能特異性靶向ZEB1 mRNA。隨后根據(jù)所用載體特點，在siRNA兩端加上相應地酶切位點、保護堿基、莖環(huán)序列等，合成靶向ZEB1 mRNA的shRNA序列，并成功將其連接到載體質(zhì)粒上。同時合成了不靶向任何mRNA的無關序列構建重組質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染篩選出穩(wěn)轉(zhuǎn)株作為陰性對照。根據(jù)質(zhì)粒的新霉素抗性和表達EGFP特點，篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞，經(jīng) Western blot證實所構建的shZEB1干擾質(zhì)?？捎行б种芞EB1在SKOV3細胞中表達，這為下一步研究抑制ZEB1表達對卵巢癌SKOV3細胞生物學特征的改變奠定了基礎。

ZEB1是上皮性鈣粘蛋白(E-cadherin)轉(zhuǎn)錄抑制因子，具有典型的鋅指結(jié)構，可以和靶基因E-cadherin啟動區(qū)的E-box結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄表達導致細胞間粘附性降低、移動性增強。EOC中miR-200c與ZEB1構成雙向負反饋環(huán)調(diào)節(jié)腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)進展。其中，ZEB1可抑制miR-200c的表達促進細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;而miR-200c表達增高又可反過來抑制靶基因ZEB1等的蛋白表達、降低癌細胞移動和生長能力。EOC臨床分級越高，ZEB1蛋白表達越高，miR-200c越少，E-cadherin蛋白降低越顯著，腫瘤多轉(zhuǎn)移和復發(fā)、預后越差［6，8］。EOC 中 ZEB1 和ZEB2、snail及Slug均可以結(jié)合在E-cadherin啟動子區(qū)的E-box上，抑制 E-cadherin基因的轉(zhuǎn)錄［9］。通過ZEB1基因沉默，可降低EOC及CSCs EMT和生長能力，從而降低轉(zhuǎn)移性和致瘤性及耐藥性、減少CSCs的抵抗性［10］。為進一步研究針對 EOC及CSCs EMT過程中的關鍵分子ZEB1進行靶向治療的價值，我們構建了人ZEB1干擾質(zhì)粒，用于ZEB1基因沉默后功能性實驗研究。從本實驗結(jié)果表明，shZEB1 SKOV3細胞內(nèi)ZEB1表達被抑制，導致SKOV3細胞克隆形成能力、遷移力及致瘤性下降，miR-200c表達增高。這些結(jié)果顯示，ZEB1可作為分子靶點用于腫瘤細胞靶向治療，為EOC及CSCs的治療提供理論和實驗研究依據(jù)。

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