張 鑫 董亞楠 楊石強(qiáng) 黃 鸝 付銀鋒 張春瑞 (河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，洛陽 471003)

目前研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞是一種功能復(fù)雜、多樣的異質(zhì)性細(xì)胞，其在機(jī)體中分布廣泛，尤其集中于血管附近，在皮膚與黏膜等與外界相鄰的組織中數(shù)量較多。肥大細(xì)胞顆粒中含有較多的組胺，是體內(nèi)組胺的主要來源。近年來研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)胞除參與機(jī)體的過敏反應(yīng)外，尚與防御、修復(fù)、抗腫瘤及組織修復(fù)與重建有關(guān)。血管活性腸多肽(Vasoactive intestinal peptide，VIP)及降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene related peptide，CGRP)是神經(jīng)末梢中廣泛分布的神經(jīng)多肽，有報(bào)道指出，在這些神經(jīng)末梢的周圍存在有豐富的肥大細(xì)胞，因此認(rèn)為這種分布與神經(jīng)-免疫對(duì)話(Nerve-immune cross-talking)機(jī)制有關(guān)［1，2］。VIP 及 CGRP 對(duì)肥大細(xì)胞功能影響的報(bào)道不多，且有相互矛盾之處［3，4］。本文應(yīng)用 VIP、CGRP分別作用于分離的大鼠腹腔肥大細(xì)胞(Rat peritonealmast cells，RPMCs)以檢測(cè)他們對(duì)大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒及細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］離子濃度的影響;同時(shí)應(yīng)用VIP受體結(jié)合抑制劑(L-8-K)預(yù)處理RPMCs，以觀察神經(jīng)多肽對(duì)大鼠肥大細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制，了解這些神經(jīng)多肽與肥大細(xì)胞的相互關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年雄性SD大鼠購(gòu)于韓國(guó)大田試驗(yàn)動(dòng)物中心，體重250～300 g。大鼠被置于層流動(dòng)物飼養(yǎng)柜中，室溫(23±2)℃，濕度(55±5)%，光照時(shí)間為7．00點(diǎn)～19．00點(diǎn)。飼以顆粒鼠飼料，自由飲水。

1．2 試劑 VIP、CGRP、L-8-K購(gòu)自 Bachem 公司;48/80復(fù)合物、HEPES、牛血清白蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Percoll細(xì)胞分離液購(gòu)自瑞典Pharmacia公司;同位素組胺檢測(cè)試劑盒、45Ca檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1．3 大鼠腹腔肥大細(xì)胞懸液的制備 用乙醚吸入麻醉SD大鼠，腹腔內(nèi)注射 HEPES-Tyrode緩沖液(136 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，11 mmol/L NaHCO3，0．6 mmol/L NaH2PO4，2.75 mmol/L MgCl2，5．4 mmol/L HEPES，1．0 g/L 牛血清白蛋白，1．0 g/L 葡萄糖，0．1 g/L 肝素，pH7．4)10 ml，輕輕按摩腹部90秒，打開腹腔，用巴氏吸管收集腹腔內(nèi)液體，以Percoll密度梯度法純化肥大細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)顯示98%是活細(xì)胞;甲苯胺藍(lán)染色檢測(cè)顯示95%的細(xì)胞是肥大細(xì)胞。純化后，用HEPES-Tyrode緩沖液將其重新混懸成1×106肥大細(xì)胞/ml，置冰上備用。

1．4 組胺檢測(cè) 按照Choi等［5］描述的免疫酶法測(cè)定肥大細(xì)胞組胺釋放率。每Eppendorf管加入肥大細(xì)胞懸液200μl，37℃ 水浴預(yù)孵5分鐘，分別加入VIP、CGRE 使成不同的終濃度，5×10－7mg/L 48/80復(fù)合物作為陽性對(duì)照，0濃度陰性對(duì)照不加作用物而加入等量HEPES-Tyrode緩沖液;繼續(xù)孵育20分鐘后，置冰上終止反應(yīng);4℃ 3 000 r/min離心10分鐘分離細(xì)胞，獲取上清液。沉淀細(xì)胞用煮沸法破碎，離心，取上清液;同位素放射酶法、液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)儀(Tri-carb 2900TR，美國(guó)Packard Bioscience公司)分別檢測(cè)兩種上清液中組胺的含量。組胺釋放百分率=上清液中組胺的釋放量/總組胺量(上清液中組胺釋放量+細(xì)胞中殘留組胺的量)×100%。

1．545Ca攝入量測(cè)定 以1×106細(xì)胞/ml的濃度將肥大細(xì)胞重新混懸于含 1．5μCi/ml45Ca的HEPES-Tyrode緩沖液中，4℃孵育10分鐘后，分裝，每Eppendorf管200μl;37℃預(yù)孵育10分鐘，分別加入VIP、CGRE使成不同的終濃度，5×10－7mg/L 48/80復(fù)合物作為陽性對(duì)照;37℃繼續(xù)孵育10分鐘后，加入4℃預(yù)冷的1 mmol/L LaCl3，終止反應(yīng);4℃3 000 r/min離心10分鐘，洗滌細(xì)胞3次;洗滌后的細(xì)胞加入10%Triton X-100劇烈震蕩破碎細(xì)胞，用液態(tài)閃爍計(jì)數(shù)儀分別檢測(cè)各組細(xì)胞的45Ca攝入量。

1．6 L-8-K對(duì)VIP誘導(dǎo)RPMC功能的抑制作用在RPMC中加入VIP之前，首先加入終濃度為5×10－6mol/L的L-8-K 25μl，37℃ 水浴預(yù)孵育5分鐘后，加入VIP使成不同的終濃度，繼續(xù)孵育20分鐘，置冰上終止反應(yīng);其余步驟同上，進(jìn)一步檢測(cè)肥大細(xì)胞釋放組胺和45Ca攝入量。

2 結(jié)果

2．1 VIP、CGRP對(duì)大鼠肥大細(xì)胞脫顆粒及組胺釋放的影響 在倒置顯微鏡下觀察，懸浮于HEPESTyrode緩沖液中的大鼠腹腔肥大細(xì)胞直徑約15 μm，圓形或卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細(xì)小顆粒，胞核明顯。5×10－7mg/L VIP和所有濃度的CGRP均不能引起大鼠肥大細(xì)胞明顯的形態(tài)變化;但5×10－7mol/L 48/80復(fù)合物、5×10－6mol/L 和 5×10－5mol/L的VIP均可引起肥大細(xì)胞脫顆粒變化，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、顆粒融合、凸出、胞內(nèi)出現(xiàn)空泡、顆粒釋放至細(xì)胞周圍等變化。

圖1 VIP和CGRP對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞組胺釋放的影響Fig．1 Effects of VIP and CGRP on histam ine release of RPMCs

同位素放射酶法檢測(cè)大鼠腹腔肥大細(xì)胞釋放組胺結(jié)果見圖1。5×10－7mg/L 48/80復(fù)合物可引起大鼠腹腔肥大細(xì)胞明顯釋放組胺(與0濃度對(duì)照組相比，P＜0．01);5×10－6mol/L 的 VIP能誘導(dǎo)大鼠腹腔肥大細(xì)胞組胺釋放率明顯增加(與0濃度對(duì)照組相比，P ＜0．05)，且隨濃度增大至5×10－5mol/L時(shí)，大鼠腹腔肥大細(xì)胞的組胺釋放量進(jìn)一步增加，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。所有濃度的CGRP不能引起大鼠腹腔肥大細(xì)胞組胺釋放率明顯改變(與0濃度對(duì)照組相比，各組 P ＞0．05)。

2．2 VIP、CGRP對(duì)大鼠肥大細(xì)胞45Ca攝取的影響5×10－7mg/L 48/80復(fù)合物可引起大鼠腹腔肥大細(xì)胞45Ca攝取明顯增加(與0濃度對(duì)照組相比，P ＜0．01);5×10－6mol/L VIP可誘導(dǎo)大鼠腹腔肥大細(xì)胞45Ca攝取明顯增加(與0濃度對(duì)照組相比，P＜0．01);且隨濃度的增加45Ca攝取量也明顯增加。各濃度CGRP組大鼠肥大細(xì)胞45Ca攝取量未見明顯增加(與0濃度對(duì)照組相比，各組 P＞0．05)，見圖 2。

圖2 VIP和CGRP對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞45 Ca的影響Fig．2 Effects of VIP and CGRP on 45 Ca influx of RPMCs

圖3 L-8-K對(duì)VIP誘導(dǎo)大鼠腹腔肥大細(xì)胞組胺釋放的影響Fig．3 L-8-K interacting VIP on histam ine release of RPMCs

圖4 L-8-K對(duì)VIP誘導(dǎo)大鼠腹腔肥大細(xì)胞45 Ca攝取的影響Fig．4 L-8-K interacting VIP on 45 Ca influx of RPMCs

2．3 L-8-K對(duì)CGRP誘導(dǎo)大鼠肥大細(xì)胞組胺釋放、鈣攝入的影響 5×10－6mg/L VIP受體抑制劑L-8-K對(duì)大鼠肥大細(xì)胞組胺釋放、鈣攝取無影響(與0濃度對(duì)照組相比，P 分別 ＞0．05)。5×10－6mg/L L-8-K處理大鼠肥大細(xì)胞后，其對(duì)5×10－6mol/L VIP和5×10－7mol/L VIP誘導(dǎo)的組胺釋放和45Ca攝取的增加均無明顯影響(與相應(yīng)濃度的VIP組相比，P分別 ＞0．05)，見圖3、4。

3 討論

肥大細(xì)胞是哺乳動(dòng)物體內(nèi)組胺貯存的主要場(chǎng)所，而在肥大細(xì)胞中組胺幾乎全部?jī)?chǔ)存于其分泌顆粒中。因此，測(cè)量大鼠肥大細(xì)胞組胺的釋放量，可以作為促顆粒釋放物質(zhì)促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒的重要指標(biāo)［4，5］。48/80 復(fù)合物是一種 N-甲基-p-甲氧苯乙胺-甲醛大分子聚合物，其具有強(qiáng)力的促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒作用［6］。研究顯示，48/80復(fù)合物分子中含有大量的陽性電荷，其不通過受體、直接作用于肥大細(xì)胞細(xì)胞膜上的G蛋白，通過一系列復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)過程引起肥大細(xì)胞的活化、釋放活性物質(zhì)，引起生理及病理反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)顯示5×10－7mg/L 48/80復(fù)合物可引起大鼠腹腔肥大細(xì)胞中釋放顆粒活性物質(zhì)，促進(jìn)鈣攝入。

圖1、2顯示，5×10－6mol/L濃度的VIP可明顯促進(jìn)大鼠腹腔肥大細(xì)胞釋放組胺和鈣攝入，且隨VIP濃度升高而升高;各濃度的CGRP則無促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放組胺和鈣攝取的作用。肥大細(xì)胞膜上是否具有神經(jīng)多肽的受體、以及神經(jīng)多肽是否通過受體作用于肥大細(xì)胞使其脫顆粒一直是人們爭(zhēng)議的問題［3，4］。在組織中，一般神經(jīng)多肽是在 pmol/L 水平上與受體結(jié)合而產(chǎn)生作用，然而神經(jīng)多肽均在較高水平(μmol/L)促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒［6］。研究認(rèn)為，帶有堿性陽離子氨基酸殘基的神經(jīng)多肽通過非受體依賴的方式，直接作用于肥大細(xì)胞膜上的G蛋白，經(jīng)過G蛋白介導(dǎo)的磷脂酶C的活化，誘發(fā)鈣離子的內(nèi)流，導(dǎo)致肥大細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)重排，進(jìn)一步引起肥大細(xì)胞脫顆粒。在這一過程中，神經(jīng)多肽分子中堿性氨基酸殘基所帶陽電荷數(shù)量、精氨酸殘基數(shù)量、及多肽分子構(gòu)型具有重要的作用［6，7］。VIP是由28個(gè)氨基酸殘基組成的肽，其分子中具有6個(gè)堿性氨基酸殘基、1個(gè)精氨酸殘基、2個(gè)酸性氨基酸殘基，共顯示4個(gè)陽電荷;CGRP是37氨基酸殘基的多肽，其分子中含有4個(gè)堿性氨基酸殘基、2個(gè)精氨酸殘基、2個(gè)酸性氨基酸殘基，共顯示2個(gè)陽電荷;本研究證實(shí)CGRP無誘導(dǎo)肥大細(xì)胞鈣離子內(nèi)流和脫顆粒的作用、表明神經(jīng)多肽在促進(jìn)大鼠肥大細(xì)胞功能活動(dòng)時(shí)，除了需有陽電荷和精氨酸外，復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)也是重要因素。

L-8-K是一種強(qiáng)力的VIP受體結(jié)合抑制劑，它可以抑制VIP引起的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能活動(dòng)［8］。本實(shí)驗(yàn)圖3、4顯示，L-8-K對(duì)VIP誘導(dǎo)的大鼠腹腔肥大細(xì)胞鈣攝取、組胺釋放均無影響，這進(jìn)一步說明了VIP誘導(dǎo)的大鼠腹腔肥大細(xì)胞脫顆粒是非受體依賴的。

本文研究結(jié)果提示，VIP是通過非受體途徑誘導(dǎo)大鼠腹腔肥大細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低和鈣內(nèi)流增加，引起肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng);且具有劑量效應(yīng)性;CGRP對(duì)大鼠腹腔肥大細(xì)胞無誘導(dǎo)活化作用。此結(jié)果顯示，不同的神經(jīng)多肽對(duì)大鼠肥大細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)作用是不同的，展示了肥大細(xì)胞與神經(jīng)系統(tǒng)聯(lián)系的多樣性。

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