杜聯(lián)峰 徐崗村 孫萬(wàn)邦 王宜峰 王勝香 羅軍敏 姚新生 夏 嬙 楊 瑞 余 妍

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海 519041)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，CJ)為人及動(dòng)物消化道共同易感菌［1］，目前CJ感染已成為全球范圍內(nèi)急性胃腸炎常見(jiàn)的病因之一［2］。CJ感染除引起急性胃腸炎外，還與格林－巴利綜合征［3－6］(Guillain－Barrésyndrome，GBS)有非常密切的關(guān)系，是導(dǎo)致兒童發(fā)生急性遲緩性癱瘓的重要病因，目前尚無(wú)有效的預(yù)防和治療措施。本室前期研究空腸彎曲菌重組蛋白PEB1免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生較高滴度特異性抗體和致敏淋巴細(xì)胞，證明PEB1重組蛋白具有良好的生物免疫活性［7，8］。由于基因疫苗成本低，能誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，被廣泛運(yùn)用于感染性疾病和腫瘤免疫治療［9－11］。本研究以空腸彎曲菌peb1A基因?yàn)榘悬c(diǎn)，構(gòu)建空腸彎曲菌核酸疫苗pcDNA3．1(－)－peb1A，采用不同免疫程序免疫昆明小鼠后檢測(cè)其抗體滴度，初步評(píng)價(jià)疫苗的生物免疫活性和免疫程序，為空腸彎曲菌DNA疫苗的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料 PCR試劑盒、各種限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA標(biāo)準(zhǔn) Marker 等購(gòu)自TAKARA公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒和NC膜等購(gòu)自上海生工生物有限公司。jetPEITM轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。質(zhì)粒大量抽提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司。HRP－羊抗大鼠IgG、IgM購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明鼠180只，雄性，每劑量組30只，6～8周齡，20～25 g/只，購(gòu)于遵義醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1．3 表達(dá)質(zhì)粒、工程菌株、細(xì)胞和蛋白 質(zhì)粒pcDNA3．1(－)，含有氨芐青霉素(Amp)和潮霉素(Hygromysin)抗性，全長(zhǎng)5．4 kb，為Invitrogen公司產(chǎn)品;重組質(zhì)粒PET28a(+)－peb1A，E．coli JM109 細(xì)菌，E．coli菌株DH5α和COS－7細(xì)胞為本室保存;CJ標(biāo)準(zhǔn)株(編號(hào)CF－1)28～31 kD外膜蛋白由本室分離純化提供，置于 －80℃保存［8］。

1．4 重組質(zhì)粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 的構(gòu)建 以重組質(zhì)粒pET28a(+)－peb1A為模板亞克隆peb1A，設(shè)計(jì) 如 下 引 物:上 游5'－CCgAATTCACCATgggCAg－CAgCCATCAT－3'，下 游 為5'－CgCAAgCTTTTATAAACCCCATTTTTTCgCT－3'。PCR擴(kuò)增peb1A基因。擴(kuò)增條件為94℃變性4分鐘，然后94℃變性30秒，53℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，最后1個(gè)循環(huán)結(jié)束后再以72℃延伸8分鐘，共30個(gè)循環(huán)?；厥占兓康钠巍Ｓ肊coRⅠ和HindⅢ雙酶切目的片段與pcDNA3．1(－)，回收純化后進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，應(yīng)用氨芐青霉素抗性平板篩選，將重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，測(cè)序鑒定。

1．5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其表達(dá)產(chǎn)物鑒定 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS－7細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入重組質(zhì)粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 與 jetPEI的混合物，37℃，5%CO2培養(yǎng)48小時(shí)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次后，加100μl含PMSF的RIPA裂解液裂解細(xì)胞30分鐘，離心取上清液，進(jìn)行SDS－PAGE電泳和 Western blot分析，其中Anti－His Tag抗體為一抗，羊抗小鼠IgGHRP為二抗，采用HRP－DAB底物顯色試劑盒檢測(cè)。

1．6 免疫分組及免疫程序 免疫接種途徑、劑量:接種前觀察昆明小鼠生活狀態(tài)5天，生活狀態(tài)正常，免疫前2天于注射處先注射0．25%利多卡因50μl/腿，免疫時(shí)于小鼠股四頭肌一點(diǎn)注射，每只小鼠100μl，實(shí)驗(yàn)組疫苗的DNA含量為100μg，空載體組疫苗DNA含量為100μg，生理鹽水組注射100 μl。每劑量組均為30只小鼠。免疫程序A方案(短程)見(jiàn)表1，免疫程序方B案(長(zhǎng)程)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果

2．1 重組真核表達(dá)載體酶切鑒定結(jié)果 隨機(jī)挑取傳化成功的單菌落，抽提質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，電泳后得到一個(gè)位于812 bp處的小片段和一個(gè)位于大小位于5 427 bp處的大片段，表明PCR擴(kuò)增出的peb1A小片段已經(jīng)成功插入到質(zhì)粒pcDNA3．1(－)的多克隆位點(diǎn)中 (圖1)。以T7啟動(dòng)子為引物進(jìn)行序列測(cè)定，經(jīng)軟件分析結(jié)果顯示獲得了正確的peb1A基因序列，插入片段閱讀框正確，質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2．2 重組質(zhì)粒在COS－7細(xì)胞中的表達(dá) 重組質(zhì)粒和 pcDNA3．1(－)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞 COS－7， Western blot鑒定，重組質(zhì)粒 pcDNA3．1(－)－peb1A 轉(zhuǎn)染的 COS－7細(xì)胞中檢測(cè)到了一條特異條帶，相對(duì)分子量在28kD左右，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞中則沒(méi)有條帶，結(jié)果見(jiàn)(圖2)。

表1 CJ p cDNA3．1(-)-peb1A免疫分組及免疫程序A方案Tab．1 The immune method of CJ pcDNA3．1(-)-peb1A on themice(A)

表2 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A免疫分組及免疫程序B方案Tab．2 The immune method of CJ pcDNA3．1(-)-peb1A on themice(B)

2．3 DNA疫苗免疫接種一般情況觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫接種后，各免疫組動(dòng)物精神狀況良好，進(jìn)食、大便情況正常，體重較免疫前稍有增加，皮毛光滑，局部注射部位無(wú)硬結(jié)、潰爛、出血，未見(jiàn)死亡。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3．1(-)-peb1A的雙酶切鑒定Fig．1 Restrictive enzyme digestion analysis of recombinant p lasm id pcDNA3．1(-)-peb1A

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞的W estern blot鑒定結(jié)果Fig．2 The results of Western blot for COS-7 cells transfected with plasm id pcDNA3．1-peb1A

小鼠血清IgG水平檢測(cè)(B方案，見(jiàn)表4):①裸DNA組IgG水平與兩對(duì)照組比較，第15天和第25天明顯增高(P＜0．05)，兩對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0．05)。②實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgG水平，第25、35、45天與第15天比較，呈逐漸下降趨勢(shì)。

小鼠血清IgG抗體最高OD值比較(A方案與B方案):小鼠血清IgG水平A免疫方案第20天達(dá)到最高值，B免疫方案第15天達(dá)到最高值。對(duì)兩免疫方案小鼠血清IgG最高OD值進(jìn)行比較，結(jié)果顯示(表5):裸DNA組A免疫方案第20天均高于B免疫方案第15天，有顯著性差異(P＜0．05)。

表3 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A免疫小鼠后血清IgG抗體OD值測(cè)定結(jié)果(A方案)Tab．3 OD values of the serum IgG antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program A)

表4 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后IgG抗體OD值測(cè)定結(jié)果(B方案)Tab．4 OD values of the serum IgG antibody levels in miceafter immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program B)

表5 A、B兩免疫方案小鼠血清IgG抗體最高OD值比較Tab．5 Comparison between immune program A and B of themax IgG OD value

2．5 小鼠血清IgM抗體水平變化檢測(cè) A免疫方案血清IgM抗體水平檢測(cè)，結(jié)果顯示(見(jiàn)表6):①裸DNA組IgM水平與兩對(duì)照組比較，第10天明顯增高，有顯著性差異(P＜0．05)。②實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgM水平，第20、30天與第10天比較，逐漸降低。

B免疫方案血清IgM抗體水平檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表7:①裸DNA組IgM水平與兩對(duì)照組比較，第15天明顯增高，有顯著性差異(P＜0．05)。②實(shí)驗(yàn)組小鼠血清IgM水平，第25、35、45天與第15天比較，逐漸降低至對(duì)照組水平。

A免疫方案與B免疫方案血清IgM抗體最高OD值比較:A免疫方案中，小鼠血清IgM水平第10天達(dá)到最高值，B免疫方案第15天達(dá)到最高值，對(duì)兩免疫方案小鼠血清IgM抗體最高OD值進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表8:裸DNA組第10天高于第15天，但是無(wú)顯著性差異(P＞0．05)。

表6 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后血清IgM抗體OD值測(cè)定結(jié)果(A方案)Tab．6 OD values of the serum IgM antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program A)

表7 CJ pcDNA3．1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后血清IgM抗體OD值測(cè)定結(jié)果(B方案)Tab．7 OD values of the serum IgM antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3．1(-)-peb1A(Program B)

表8 A、B免疫方案小鼠血清IgM抗體最高OD值比較Tab．8 Comparison between immune program A and B of themax IgM OD value

3 討論

DNA疫苗具有制備簡(jiǎn)單、成本較低、使用簡(jiǎn)單;其在體內(nèi)可長(zhǎng)期表達(dá)抗原蛋白，產(chǎn)生持久應(yīng)答;質(zhì)粒載體免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)［12，13］。自上世紀(jì)90年代初問(wèn)世以來(lái)，已在多種疾病的防治研究中顯示出巨大的應(yīng)用潛力，但是裸DNA疫苗接種存在劑量偏大、生物利用度低、持續(xù)時(shí)間不夠長(zhǎng)等缺點(diǎn)。主要因?yàn)槁鉊NA疫苗注射給藥后，經(jīng)過(guò)細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)的停留直至轉(zhuǎn)錄期間，絕大多數(shù)會(huì)被核酸酶降解失活。為了增強(qiáng)DNA疫苗的免疫保護(hù)效果，已進(jìn)行的探索包括對(duì)保護(hù)性抗原、表達(dá)載體、免疫佐劑、免疫途徑等策略的優(yōu)化［14－17］。

研制基因疫苗的前提和關(guān)鍵是候選基因的確定和獲得。近年對(duì)CJ致病機(jī)制和相關(guān)致病基因的研究發(fā)現(xiàn):由peb1A基因編碼表達(dá)的PEB1蛋白存在于98%CJ菌體表面，具有十分穩(wěn)定而保守的免疫原性［18，19］。鑒于該蛋白在CJ致腸道感染中的特殊重要性，且其編碼基因非常保守，我們選用peb1A基因作為DNA疫苗的抗原基因?；虮磉_(dá)載體的選擇對(duì)基因轉(zhuǎn)染能否成功也很關(guān)鍵，pcDNA3．1(－)能使外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得瞬時(shí)或穩(wěn)定的表達(dá)，是一個(gè)理想的真核質(zhì)粒表達(dá)載體。COS－7細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)是迅速把克隆化基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞上表達(dá)的常用方法。因此，我們選擇peb1A基因?yàn)槟康目乖颍瑯?gòu)建了重組質(zhì)粒 pcDNA3．1(－)－peb1A。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、PCR和 DNA測(cè)序鑒定，并證實(shí)構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞COS－7，免疫印跡技術(shù)檢測(cè)重組質(zhì)粒在 COS－7細(xì)胞中較好的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)采用的肌肉注射法是目前基因疫苗免疫最常用的方法，對(duì)于空腸彎曲菌這種胞外菌的感染，主要依靠體液免疫特異性抗體殺滅細(xì)菌、中和毒素來(lái)發(fā)揮免疫保護(hù)作用。在本實(shí)驗(yàn)中，CJ基因疫苗免疫小鼠后，裸DNA組與空載體和NS對(duì)照組比較，均誘導(dǎo)產(chǎn)生了一定滴度的特異性IgM和IgG，說(shuō)明CJ基因疫苗具有一定的免疫原性，能誘發(fā)小鼠機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。

本研究成功構(gòu)建空腸彎曲菌peb1A基因真核表達(dá)載體并在 COS－7細(xì)胞中正確表達(dá)。CJ pcDNA3．1(－)－peblA 疫苗具有免疫原性，在同一劑量以短程的免疫程序和長(zhǎng)程的免疫程序進(jìn)行比較，結(jié)果肌肉注射方式，短程免疫效果較理想。疫苗接種后介導(dǎo)特異性IgM和IgG抗體應(yīng)答與一般疫苗免疫應(yīng)答規(guī)律相同。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究空腸彎曲菌DNA疫苗能否使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)力，降低感染發(fā)生率和死亡率，提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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