張曉娟 ，郝子琪 ，楊大威 ，孟玉平 ，曹秋芬

（1.山西大學生物工程學院，山西太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心，山西太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學研究生院，山西太谷 030801）

植物是一個需氧代謝的有機體，在呼吸和光合作用過程中均會導致活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）含量的提高。當ROS積累到一定水平便會對植物造成一定的傷害。植物為了抵御氧化脅迫，建立了相應的清除活性氧的體系。在植物葉綠體和胞質(zhì)中，有一種H2O2清除系統(tǒng)稱為抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)，其中，抗壞血酸過氧化物酶（APX）是這個循環(huán)的關(guān)鍵酶之一[1-3]。有研究表明，高等植物中APX在清除活性氧時，對底物抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）有極高的專一性，且ASA在較低水平就能發(fā)揮作用[3]。

Halliwell等[4]于1976年首先發(fā)現(xiàn)了過氧化物酶。1981年，Nakano等[5]才正式確定其為抗壞血酸過氧化物酶。在之后30 a的研究中發(fā)現(xiàn)，提高植物體內(nèi)抗氧化酶活性和增強抗氧化代謝水平是提高植物抗逆性的有效途徑之一。APX能提高氧化耐受性的作用已在許多植物中報道，目前，多種植物的APX基因已被克隆并應用于植物轉(zhuǎn)基因的研究[6]。但對于木本果樹植物，因其遺傳背景非常復雜，研究它們的APX基因也有很大難度，至今僅克隆到了蘋果的APX基因[7]和葡萄抗白粉病的APX基因[1，3]。

棗樹是我國黃土高原上古老的果樹，具有耐瘠薄、抗逆性強等許多優(yōu)良特性。挖掘和研究棗樹的抗逆性基因?qū)τ谥参锏沫h(huán)境脅迫研究及品種改良具有十分重要的意義。因此，本研究從山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心構(gòu)建的棗樹結(jié)果枝cDNA文庫中篩選獲得了抗壞血酸過氧化物酶基因cDNA序列，并進行了原核表達載體的構(gòu)建和蛋白誘導表達的研究，旨在為棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因生物學功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因（ZjAPX）cDNA序列從山西省農(nóng)科院生物技術(shù)研究中心構(gòu)建的壺瓶棗（Ziziphus jujubaMill hupingzao）結(jié)果枝cDNA文庫[8]中隨機篩選獲得。所用載體有：克隆載體pSPORT1，原核表達載體pGEX-4T-2，大腸桿菌菌株BL21（DE3）。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒QIAquick購自QIAGEN公司；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SmaⅠ，T4 DNA連接酶，DNA Marker等均購自大連寶生物工程有限公司。氨芐青霉素、IPTG、丙烯酰胺等化學試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。

1.2 方法

1.2.1 棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因（ZjAPX）cDNA的氨基酸序列分析 用序列處理在線工具包（SMS）（http://www.bio-soft.net/sms/index.html）翻譯其核苷酸序列。

1.2.2ZjAPX原核表達載體的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)ZjAPX核苷酸序列選擇其中648 bp（106～753 bp）設(shè)計特異性引物（引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成），上游引物為：5'-AT GGATCCATGCTACGCCTTGCATG-3'（下劃線處為BamHⅠ位點）；下游引物為：5'-ATCCCGGGT TAAGCATCAGCAAATC-3'（下劃線處為SmaⅠ位點）；利用PCR的方法獲得其cDNA片段。PCR反應體系為：10×PCR buffer 5 μL（含 Mg2+），dNTP1μL，上下游引物各 1 μL（20 pmol/L），rTaq聚合酶 0.3 μL，模板 DNA 1 μL（1.0 μg/μL），滅菌超純水40.7 μL，總體積50 μL。擴增條件為：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后 72℃延伸10 min。

將獲得的cDNA片段用BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切目的基因片段及pGEX-4T-2載體，用QIAquick凝膠回收盒對雙酶切產(chǎn)物進行純化。

○R在T4 DNA連接酶的作用下，將目的基因定向克隆到pGEX-4T-2載體上，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，進行藍白斑選擇，對陽性菌落提取質(zhì)粒，并用限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒（pGEX-4T-2-ZjAPX）進行酶切鑒定。將鑒定的含有片段的陽性菌株送往上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序，驗證重組質(zhì)粒讀碼框的正確性。

1.2.3 ZjAPX蛋白的原核表達 挑取1.2.2讀碼框正確的pGEX-4T-2-ZjAPX菌液于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，第2天按1/100接菌，培養(yǎng)至OD600值為0.5左右，加入IPTG，至終培養(yǎng)液內(nèi)IPTG濃度為1.0 mmol/L誘導培養(yǎng)，4 h后取2 mL菌液用于SDS-PAGE電泳，檢測蛋白有無表達[9]，以不含插入子的空載體pGEX-4T-2轉(zhuǎn)化BL21（DE3）作為空白對照；設(shè) IPTG終濃度為 0.1，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6 mmol/L，觀察不同濃度IPTG在誘導4 h后蛋白的表達量；IPTG終濃度為1.2 mmol/L條件下，分別誘導 1，2，3，4，5，6 h 取樣，觀察不同誘導時間下蛋白的表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZjAPX基因cDNA序列及編碼的氨基酸序列特征

ZjAPX基因是從山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究中心構(gòu)建的壺瓶棗結(jié)果枝cDNA文庫中篩選得到的抗壞血酸過氧化物酶基因，其cDNA序列及編碼的氨基酸序列如圖1所示。

2.2 ZjAPX原核表達載體的構(gòu)建

PCR擴增后電泳觀測得出，在500～750 bp之間、靠近750 bp的1條帶，與所設(shè)計的擴增目的片段大小吻合。

將PCR產(chǎn)物和pGEX-4T-2載體進行連接、酶切，鑒定結(jié)果如圖2所示，雙酶切片段約為750 bp，與預期結(jié)果相符。測序結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒中確實含有目的片段，且讀碼框正確，表明重組載體pGEX-4T-2-ZjAPX構(gòu)建成功。

2.3 ZjAPX基因在E.coli體內(nèi)的表達

含有重組載體pGEX-4T-2-ZjAPX和空載體pGEX-4T-2的菌株過夜培養(yǎng)后，1.0 mmol/L的IPTG誘導4 h，觀察蛋白的表達。結(jié)果（圖3）表明，pGEX-4T-2-ZjAPX菌株在大約48 KD處誘導出1條較粗的蛋白條帶（GST大小約26 KD，目的蛋白大小為23.62 KD），而對照菌株pGEX-4T-2沒有該條帶。

進一步分析不同濃度IPTG和不同誘導時間對ZjAPX蛋白表達量的影響，結(jié)果顯示，分別加入 0.1，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6 mmol/L 的 IPTG 誘導蛋白表達時，當濃度為1.2 mmol/L時，誘導蛋白的表達量最大（圖4）；濃度為1.2 mmol/L時，分別誘導 1，2，3，4，5，6 h 后取樣進行 SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，誘導5 h，ZjAPX蛋白的表達效果最好（圖5）。由此證明，ZjAPX蛋白在IPTG濃度為1.2 mmol/L、誘導5 h時，表達效果最好。

3 討論

抗壞血酸過氧化物酶存在于植物、真核藻類及某些藍細菌中[10]。另外，在家蠅[11]中也檢測出APX活性。APX作為重要的抗氧化酶在清除活性氧的過程中起著重要作用。在高等植物中，APX具有4種不同細胞定位的同工酶：微體APX（mbAPX）、胞質(zhì) APX（cAPX）、葉綠體（sAPX和 tAPX）和過氧化體 APX（miAPX）[12-13]。APX催化的反應為：2AsA＋H2O2→MDA（單脫氫抗壞血酸）＋2H2O。APX是以抗壞血酸為電子供體，對底物AsA有極高的專一性[14]，在氧化AsA的同時，將H2O2還原為H2O，是AsA的主要消耗者[15]。在APX活性提高的同時，反應底物也需要同時增加，這樣催化反應才能繼續(xù)，才能清除更多的活性氧。人們已從番茄、煙草、玉米、棉花、擬南芥等植物中克隆了APX基因，并進行了部分轉(zhuǎn)基因植物的研究。Kornyeyev等[16]獲得了轉(zhuǎn)葉綠體APX基因的棉花植株，APX在植物體內(nèi)過量表達，其葉片中APX活性比野生型提高了5倍，轉(zhuǎn)基因棉花具有較高的PSⅡ光化學活性和抗氧化能力。Murgia等[17]研究結(jié)果表明，過量表達擬南芥tAPX基因能增加對百草枯引起的氧化脅迫的抗性。Xu等[18]獲得轉(zhuǎn)大麥HvAPX1的擬南芥植株，其對鹽的耐性增強。Shi等[19]轉(zhuǎn)自大麥的HvAPX1提高了擬南芥對高溫脅迫的抗性[19]。Wang等[20]獲得的轉(zhuǎn)tAPX煙草植株，其APX活性明顯提高，抗低溫的能力也增強。Charles等[21]在研究大豆cAPXs中觀察到，APX的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后調(diào)控可能增強農(nóng)作物抵抗環(huán)境脅迫的能力。

本研究從棗樹cDNA文庫中篩選得到了ZjAPX基因的cDNA全序列，用序列處理在線工具包（SMS）翻譯出核苷酸序列；將其構(gòu)建原核表達載體，成功誘導了蛋白表達，為進一步研究棗樹ZjAPX基因表達蛋白奠定了基礎(chǔ)。棗樹原產(chǎn)于黃土高原，其體內(nèi)具備適應土壤瘠薄、干旱等逆境條件的抗氧化防御系統(tǒng)，我們已經(jīng)構(gòu)建了棗樹ZjAPX的植物表達載體[22]，將進一步進行植物體內(nèi)ZjAPX功能的探討。

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