張瑋瑋，王家官

（1.山西生物應(yīng)用職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)廳農(nóng)墾局，山西太原 030031）

鈷（Co）屬鐵族元素，為順磁性銀白色金屬。半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，鈷的研究取得了很大進(jìn)展，迄今為止，已證實(shí)鈷元素是人體、動(dòng)物、藻類、微生物及豆科作物等所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素[1-2]，是植物生長(zhǎng)的有益元素，對(duì)多種農(nóng)作物有增產(chǎn)作用[3]。大量研究表明，鈷及其化合物具有一定的生物學(xué)效應(yīng)和藥理作用。在高等植物中，鈷可以提高葉片葉綠素含量，增強(qiáng)植株的光合作用，對(duì)多種作物有增產(chǎn)作用。鈷參與機(jī)體酶的組成以及對(duì)酶具有活化作用，可治療多種貧血；鈷鹽對(duì)低色素小細(xì)胞性貧血的療效較好；鈷參與構(gòu)造維生素B12的特定結(jié)構(gòu)，對(duì)高色素巨細(xì)胞性貧血療效顯著，因而，鈷的研究引起了人們的重視[4-5]。目前，在藻類中也開(kāi)展了一些工作，崔青曼等[6]試驗(yàn)表明，低濃度的鈷對(duì)小球藻、極大螺旋藻的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。重金屬對(duì)藻類生物的影響主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面是重金屬對(duì)藻類的致毒效應(yīng)，另一方面是重金屬可提高藻類的新陳代謝過(guò)程，促進(jìn)生長(zhǎng)[7]。比較重要的微量金屬有Fe，Mn，Cu，Mg，Mo，Co等，其主要機(jī)理是作為輔助因子參與生物生化反應(yīng)，以促進(jìn)生物增殖。在對(duì)汾河水庫(kù)水體監(jiān)測(cè)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，鈷濃度的變化與硅藻、綠藻的消長(zhǎng)有一定的相關(guān)性。

本試驗(yàn)采用藻類增長(zhǎng)潛力試驗(yàn)（AGP）探討了鈷對(duì)脆桿藻（硅藻）和斜生柵藻（綠藻）細(xì)胞增殖的影響，以期從微量元素角度探討汾河水庫(kù)浮游藻類細(xì)胞密度上升較快的原因,為防治水體富營(yíng)養(yǎng)化提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的藻種是脆桿藻（Fragilariasp.Fachb-218）和斜生柵藻（Scenedesmus obiquus）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藻種的馴化與培養(yǎng) 將藻種在MGC－300B型微電腦控制光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行無(wú)菌馴化培養(yǎng)。斜生柵藻選用BG11培養(yǎng)基，脆桿藻選用D1培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度2 000 lx，光暗比14 h∶10 h。經(jīng)過(guò)14～21 d的馴化培養(yǎng)，藻種可達(dá)到試驗(yàn)要求。

1.2.2 Co2+質(zhì)量濃度梯度的培養(yǎng)基配制 用Co（NO3）2·6H2O配置系列 Co2+質(zhì)量濃度梯度的培養(yǎng)基，如表1所示。

表1 培養(yǎng)基中Co2＋的質(zhì)量濃度梯度

1.2.3 接種 用722S分光光度計(jì)測(cè)出斜生柵藻與脆桿藻藻種液的細(xì)胞光密度值為0.1～0.2時(shí)，進(jìn)行接種。取50 mL藻種液，在3 500 r/min下離心10 min，棄上清液。沉淀的藻細(xì)胞用0.001 5%碳酸氫鈉水溶液重新懸浮，再離心，以除去營(yíng)養(yǎng)物及其他物質(zhì)。這樣的洗滌過(guò)程進(jìn)行2次，最后用碳酸氫鈉水溶液再懸浮（碳酸氫鈉液的體積根據(jù)已計(jì)算出的用于接種時(shí)所需要的藻種液的細(xì)胞密度來(lái)確定）。接種完畢，錐形瓶用透氣膜封蓋，在設(shè)定條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 試驗(yàn)條件 斜生柵藻培養(yǎng)溫度（25±1）℃，脆桿藻培養(yǎng)溫度（22±1）℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光暗比14 h∶1 0 h。為減少因光照不均勻可能造成的影響，每隔2～3 h搖動(dòng)并更換各試驗(yàn)組錐形瓶的位置1次。保持試驗(yàn)液pH值≤8.5。

1.2.5 光密度（OD）值與葉綠素 a（Chla）的測(cè)定

培養(yǎng)液中藻細(xì)胞密度能決定其光密度（OD）的大小和葉綠素a（Chla）含量的高低。本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定試驗(yàn)液中OD和Chla的數(shù)值來(lái)說(shuō)明2種藻的細(xì)胞密度消長(zhǎng)狀況。

OD值的測(cè)定：先用紫外分光光度計(jì)測(cè)定斜生柵藻和脆桿藻的全吸收波譜，確定它們的吸收峰，然后將試驗(yàn)液在722S可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定OD值。斜生柵藻和脆桿藻測(cè)定750 nm（吸收峰）處的OD值。從試驗(yàn)第2天開(kāi)始，每隔1 d測(cè)定1次，直到試驗(yàn)結(jié)束，每次測(cè)定的時(shí)間基本相同。

葉綠素a的測(cè)定：采用甲醇萃取法。取3 mL試驗(yàn)藻液在3 500 r/min下離心10 min，棄去上清液，然后等體積加入90%（V/V）無(wú)水甲醇，混勻，放置在4℃黑暗條件下萃取6～8 h，離心，取上清液，在722S可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定665 nm處光密度值。根據(jù)公式C（μg/mL）＝OD665×13.9，計(jì)算出葉綠素a的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈷對(duì)脆桿藻增殖的影響

2.1.1 不同質(zhì)量濃度（A～E）Co2+對(duì)脆桿藻OD值的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，在試驗(yàn)的前4 d，脆桿藻處于增殖的調(diào)整期，從第7天開(kāi)始，A，B，C，D組的該藻細(xì)胞均不同程度進(jìn)入分裂增殖對(duì)數(shù)期，B，C組增長(zhǎng)幅度較大，并一直呈上升趨勢(shì)，而D，E組雖也增長(zhǎng)但趨勢(shì)比較緩慢，直到第8天后，開(kāi)始有緩慢增殖。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，當(dāng)Co2+質(zhì)量濃度在0.120 0～0.167 8 μg/L之間時(shí)，脆桿藻增殖比較明顯；當(dāng)Co2+質(zhì)量濃度達(dá)到0.284 9 μg/L時(shí)，該藻的增殖受到很大抑制，至第12天細(xì)胞分裂基本停止。

由B組與D組細(xì)胞吸光值的t檢驗(yàn)結(jié)果得出，B組與D組之間存在顯著性差異（P＜0.05）。此檢驗(yàn)說(shuō)明，在氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽等條件適宜的情況下，低質(zhì)量濃度的鈷對(duì)脆桿藻藻細(xì)胞的增殖有明顯的促進(jìn)作用。

2.1.2 不同質(zhì)量濃度（A～E）Co2+對(duì)脆桿藻葉綠素a含量的影響 葉綠素a的含量能反映出不同鈷質(zhì)量濃度下脆桿藻細(xì)胞的增殖狀況。從圖2可以看出，Co2+質(zhì)量濃度為0.120 0 μg/L時(shí)（B組），葉綠素a含量增長(zhǎng)較快；Co2+質(zhì)量濃度在0.229 1～0.284 9 μg/L之間時(shí)，葉綠素a含量增長(zhǎng)受到抑制。

從圖2可以看出，脆桿藻葉綠素含量的變化與OD值變化趨勢(shì)基本一致，呈正相關(guān)。圖1顯示，A組在接種7 d后細(xì)胞分裂進(jìn)入對(duì)數(shù)期，但增長(zhǎng)幅度較小，到第10天達(dá)到最大值，以后呈下降趨勢(shì)。其變化趨勢(shì)與B組、C組類似。圖2顯示，A組與B組、C組的變化趨勢(shì)基本一致。A組的這種變化趨勢(shì)的原因可能是脆桿藻對(duì)鈷元素的需要極其微量，在接種之前藻細(xì)胞中已含有的鈷元素維持了它前期細(xì)胞增殖的需要，隨著鈷元素消耗，細(xì)胞密度明顯下降（圖1）。

2.2 鈷對(duì)斜生柵藻增殖的影響

2.2.1 不同質(zhì)量濃度（A～G）Co2+對(duì)斜生柵藻光密度值的影響 試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，在試驗(yàn)的前4 d，斜生柵藻處于增殖的調(diào)整期，從第5天開(kāi)始，各試驗(yàn)組的該藻細(xì)胞均不同程度進(jìn)入分裂增殖對(duì)數(shù)期，B，C，D組增長(zhǎng)幅度較大，并一直呈上升趨勢(shì)，而E，F(xiàn)，G組增長(zhǎng)趨勢(shì)比較緩慢，尤其G組到12 d后細(xì)胞分裂基本停止。試驗(yàn)結(jié)果還顯示，當(dāng)Co2+質(zhì)量濃度在0.120 0～0.229 1 μg/L之間時(shí)，斜生柵藻的增殖比較明顯；當(dāng)Co2+質(zhì)量濃度達(dá)到0.328 1 μg/L時(shí)，該藻的增殖受到抑制，接種后至第10天細(xì)胞分裂緩慢。當(dāng)Co2+質(zhì)量濃度達(dá)到0.328 1 μg/L以上時(shí)，該藻生長(zhǎng)繁殖基本停止。

C組與E組細(xì)胞吸光值的t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，C組與E組之間有顯著性差異（P＜0.05）。C組鈷的質(zhì)量濃度為0.167 8 μg/L，E組鈷的質(zhì)量濃度為0.284 9 μg/L。此檢驗(yàn)說(shuō)明，在氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽等條件適宜的情況下，低質(zhì)量濃度的鈷對(duì)斜生柵藻藻細(xì)胞的增值有明顯的促進(jìn)作用。

2.2.2 不同質(zhì)量濃度（A～G）Co2+對(duì)斜生柵藻葉綠素a含量的影響 葉綠素a的含量能反映出不同鈷質(zhì)量濃度下斜生柵藻細(xì)胞的增殖狀況。結(jié)果顯示，Co2+質(zhì)量濃度為 0.167 8 μg/L時(shí)（C組），葉綠素a含量增長(zhǎng)較快；Co2+質(zhì)量濃度在0.284 9～0.350 0 μg/L之間時(shí)，葉綠素a含量增長(zhǎng)受到抑制。

從圖3，圖4可以看出，A組與B組、C組的變化趨勢(shì)基本一致。由此可以得出，斜生柵藻與脆桿藻一樣，對(duì)于鈷元素含量的要求都非常低。

2.3 汾河水庫(kù)中鈷的含量及其與浮游藻類密度的關(guān)系

汾河水庫(kù)位于山西省太原市西北婁煩縣境內(nèi)，下靜游村至下石家莊之間引黃入晉工程實(shí)施后，汾河水庫(kù)作為黃河水的調(diào)蓄水庫(kù)，擔(dān)負(fù)起省城340萬(wàn)人的飲水供應(yīng)任務(wù)，成為省城最主要的水源地。自1961年建成后，其水質(zhì)良好，一直保持在國(guó)家地表水環(huán)境質(zhì)量Ⅱ類水標(biāo)準(zhǔn)（GB 3838—88）。但是1999年以來(lái)，由于我國(guó)華北地區(qū)連續(xù)干旱和上游用水量增加等原因，使庫(kù)區(qū)蓄水量急劇減少，環(huán)境容量迅速萎縮，加之面源、點(diǎn)源和內(nèi)源的污染，使庫(kù)區(qū)水體中浮游藻類的密度上升較快。初步調(diào)查顯示，除了上述原因造成庫(kù)區(qū)水體中以N，P為主的營(yíng)養(yǎng)鹽含量增長(zhǎng)以外，微量元素也起著一定作用。

2010年4月、9月與2011年5月、9月對(duì)汾河水庫(kù)8個(gè)斷面的微量元素進(jìn)行檢測(cè)，鈷的含量在不同的時(shí)間段變化趨勢(shì)不同，其結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，2010年4月和2011年5月這2個(gè)月份中Co2+的含量比較高；而2010年9月和2011年9月Co2+的含量卻相對(duì)較低。汾河水庫(kù)浮游藻類密度隨著季節(jié)的變化而改變，在相應(yīng)的時(shí)間內(nèi)硅藻、綠藻和藍(lán)藻的密度變化如圖6所示。

在庫(kù)區(qū)水體物理、化學(xué)指標(biāo)一定的前提下，從圖5，6可以看出，水體中鈷的質(zhì)量濃度同浮游藻類中硅藻、綠藻的生長(zhǎng)有一定的相關(guān)性，即當(dāng)鈷的含量較高時(shí)，硅藻、綠藻的細(xì)胞密度相應(yīng)較少，同時(shí)由于4，5月光照弱、水溫低，不利于藻類的生長(zhǎng)，所以，藻細(xì)胞密度較少；反之，當(dāng)鈷的含量較低時(shí)，硅藻、綠藻的細(xì)胞密度會(huì)相應(yīng)增加，同時(shí)由于9月光照強(qiáng)、水溫高，有利于藻類的生長(zhǎng)，所以，藻細(xì)胞密度較多。而對(duì)于藍(lán)藻來(lái)說(shuō)，鈷的含量多少對(duì)其生長(zhǎng)影響沒(méi)有規(guī)律性。這一結(jié)論與AGP試驗(yàn)結(jié)果剛好吻合。這表明，低質(zhì)量濃度的鈷常具有促進(jìn)藻類生長(zhǎng)的作用，而高質(zhì)量濃度的鈷則有抑制作用，嚴(yán)重時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒害作用。

3 結(jié)論與討論

鈷是藻類許多生理過(guò)程中起重要作用的微量元素，在適當(dāng)?shù)臐舛认驴纱龠M(jìn)許多酶的活性。草酰乙酸脫羧酶是一種催化CO2分子從草酰乙酸上脫落下來(lái)的酶，Co2+的質(zhì)量濃度對(duì)該酶的活性有很大的影響，低質(zhì)量濃度時(shí)，酶的活性較高，而高質(zhì)量濃度時(shí)酶的活性會(huì)受到很大程度的抑制。鈷離子能使核酸解聚，結(jié)合在磷酸酯基上的金屬離子可從RNA和多核酸的磷酸二酯鏈上奪取電子，從而使得成鍵不穩(wěn)定和易水解，這樣生物大分子可降解成小碎片，從而使生物機(jī)體發(fā)生病變[7-8]。錳、鎳等也可促使這種降解作用。一般情況下，重金屬對(duì)藻類的致毒效應(yīng)主要表現(xiàn)在：影響藻類的生長(zhǎng)代謝、抑制光合作用、減少細(xì)胞色素，導(dǎo)致細(xì)胞畸變[9-10]。

無(wú)論是在人工培養(yǎng)液還是天然水體中，重金屬的種類與數(shù)量都不可能是單一的、固定不變的，各種水生生物，包括藻類，常受到多種重金屬聯(lián)合作用的綜合影響。重金屬彼此間的相互作用有拮抗、協(xié)同、相加和致敏4種，已查明，許多成對(duì)的元素在生物學(xué)上表現(xiàn)出拮抗效應(yīng)[11]，常見(jiàn)的有：Hg－Cu，Cd－Zn，F(xiàn)e－Mn，Cu－Co等；有時(shí)是2種以上的元素起作用，如：Co－Cu－Mn。在高等植物中，鈷可以提高番茄葉片葉綠素含量、增強(qiáng)植株的光合作用，并顯著提高番茄的坐果率、單株結(jié)果數(shù)和產(chǎn)量。

本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，脆桿藻和斜生柵藻在不同的鈷質(zhì)量濃度下增長(zhǎng)的情況不同，在質(zhì)量濃度較低時(shí)，影響藻類的生長(zhǎng)代謝；在適宜的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，能增強(qiáng)藻類的光合作用，使藻細(xì)胞數(shù)量增殖較快；質(zhì)量濃度較高時(shí)，藻細(xì)胞數(shù)目增殖較慢，原因可能是藻類生長(zhǎng)除了受鈷的影響外，還受到其他一些因素的影響，如金屬間的相互作用等。

［1］陳仕光，孫洪偉，王志紅.典型微量營(yíng)養(yǎng)元素P，F(xiàn)e，Mn，Zn對(duì)藍(lán)藻藻華影響研究 [J].廣東工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011（2）：10-15.

［2］樊文華，李莉.硒鈷配施對(duì)番茄產(chǎn)量、番茄紅素及硒、鈷含量的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（10）：19-22.

［3］陳仕光，王志紅，曹欣.典型性微量金屬元素對(duì)藻華的激勵(lì)趨勢(shì)探討 [J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010（2）：85-92.

［4］邱保勝，劉樹(shù)文，戴國(guó)政.藻類利用微量金屬元素的研究技術(shù)與方法[J].水生生物學(xué)報(bào)，2009，33（2）：330-337.

［5］劉素萍，樊文華.鈷對(duì)番茄生長(zhǎng)發(fā)育影響的初步研究[J].土壤通報(bào)，2005，36（6）：425-428.

［6］崔青曼，幺宗利，袁春英.極大螺旋藻培養(yǎng)液中5種微量元素最佳濃度的研究[J].齊魯漁業(yè)，2002，19（9）：1-3.

［7］鄧衛(wèi)東，毛華明.微量元素鋅和鈷的生物學(xué)功能和營(yíng)養(yǎng)狀況的評(píng)價(jià)[J].云南畜牧獸醫(yī)，1999（2）：20-22.

［8］李洪益.重要的微量元素鈷 [J].微量元素與健康研究，2004，21（1）：61-62.

［9］郁建栓.淺談重金屬對(duì)生物毒性效應(yīng)的分子機(jī)理[J].環(huán)境污染與防治，1996，18（4）：28-31.

［10］況琪軍，夏宜，惠陽(yáng).重金屬對(duì)藻類的致毒效應(yīng)[J].水生生物學(xué)報(bào)，1996，20（3）：277-283.

［11］李建國(guó)，王金莉.微量元素之間的協(xié)同與頡頏 [J].飼料博覽，2004（7）：28-30.