朱進(jìn)清，王 青，羊小海，王柯敏，楊麗娟，丁 靜，周 冰

（湖南大學(xué)化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，化學(xué)化工學(xué)院，生物納米與分子工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410082）

0 引言

DNA分子的檢測(cè)對(duì)于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、臨床診斷、基因治療、藥物的研制與開(kāi)發(fā)、環(huán)境監(jiān)測(cè)等方面的研究均具有十分重要的意義[1～2]。因此，發(fā)展高靈敏的檢測(cè)DNA分子的方法成為研究的熱點(diǎn)之一。其中，生物傳感器技術(shù)由于檢測(cè)快速靈敏、選擇性好、穩(wěn)定性高及較低的成本[3～4]，成為檢測(cè)DNA分子的重要手段。

近年來(lái)，隨著科學(xué)研究的不斷深入，有越來(lái)越多的問(wèn)題需要高靈敏的檢測(cè)技術(shù)來(lái)解答。如：對(duì)于疾病早期階段的少量堿基突變DNA序列的檢測(cè)。因此，如何提高檢測(cè)靈敏度成為生物傳感器技術(shù)發(fā)展的方向之一。由于納米顆粒制備簡(jiǎn)單、易于修飾和保存，并具有良好的生物相容性與獨(dú)特的光電性質(zhì)，因此基于納米顆粒的放大技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生化檢測(cè)中。如Ding等[5]報(bào)道了一種采用陽(yáng)極溶出CdS量子點(diǎn)的方法來(lái)放大檢測(cè)DNA序列；Wang等[6]將二茂鐵的衍生物巰基二茂鐵與信號(hào)探針一起修飾到納米金顆粒上，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的放大檢測(cè)。除此之外，有些研究工作基于納米顆粒構(gòu)建了二次放大的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。如利用DNA功能化的納米金顆粒與目標(biāo)物、捕獲探針形成“三明治”結(jié)構(gòu)，再通過(guò)銀增強(qiáng)[7]或金增長(zhǎng)[8～9]的方法使信號(hào)進(jìn)一步放大。Zhang等[10]將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記在納米金顆粒上，通過(guò)酶催化放大與納米顆粒放大相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物的二次放大檢測(cè)。

該文發(fā)展了一種基于DNA功能化納米金顆粒 “樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)信號(hào)的方法實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)DNA的檢測(cè)。該方法中利用兩種DNA功能化的納米金顆粒進(jìn)行兩次“三明治”雜交，從而在電極表面自組裝成“樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)，可靈敏地檢測(cè)DNA。相比只利用納米金顆粒放大的方法而言，其檢測(cè)限降低了4倍。同時(shí)該傳感器對(duì)含有錯(cuò)配位點(diǎn)的序列亦具有較好的選擇性。該文構(gòu)建的方法有望推廣至小分子或者蛋白質(zhì)等目標(biāo)物的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑及儀器

氯金酸（HAuCl4·4H2O，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），二水合檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7·2H2O，上海試劑一廠(chǎng)）用于納米金顆粒的制備。 巰基己醇（97%，C6H14OS，MCH，Simga公司）用來(lái)封閉傳感芯片，以減少表面的非特異性吸附。釕胺（RuHex，Sigma公司）用作電活性分子。實(shí)驗(yàn)中所用的DNA均購(gòu)自大連寶生物有限公司，其堿基序列見(jiàn)表1。所有DNA均溶于10 mmol/L PBS 緩沖溶液（pH7.4，0.2 mol/L NaCl）中。如沒(méi)有特別說(shuō)明，其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為 18.2 MΩ·cm 超純水。

表1 所用DNA的序列Tab.1 Sequence of synthesized oligonucleotides used in the work

電化學(xué)工作站（CHI 660C型，上海辰華儀器公司）用于電化學(xué)測(cè)定，UV-1601型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）用于紫外可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定。SB2200型超聲清洗器（上海必能信超聲有限公司）用于金電極和器皿的清洗。臺(tái)式離心機(jī)（Beckman公司）用于納米金顆粒的洗滌與純化。

1.2 納米金顆粒的制備與修飾

參照文獻(xiàn)制備[11]和修飾[12]納米金顆粒，并用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行表征。

1.3 金電極的表面處理與修飾

在新處理好的金電極表面滴加20 μL 0.1 μmol/L巰基DNA1，室溫下反應(yīng)2 h之后用10 mmol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗。然后將20 μL 1 mmol/L MCH滴在金電極表面，室溫反應(yīng)1 h后用10 mmol/L PBS緩沖液反復(fù)沖洗。最后將電極表面用氮?dú)獯蹈桑瑐溆谩?/p>

1.4 雜交反應(yīng)

首先，在巰基DNA1修飾的電極表面滴加10 μL不同濃度的cDNA與10 μL巰基DNA2修飾的納米金顆粒（DNA2-AuNPs）的混合液，在 37°C下孵育2 h。之后用10 mmol/L PBS反復(fù)清洗，以除去未反應(yīng)的目標(biāo)cDNA和DNA2-AuNPs。然后將50 nmol/L cDNA與巰基DNA1修飾的納米金顆粒（DNA1-AuNPs）于 37℃下孵育 30 min，8 000 r/min的速度離心30 min，重復(fù)洗滌兩次后得到cDNA/DNA1-AuNPs。 取 20 μL cDNA/DNA1-AuNPs滴到電極表面，37℃下雜交 2 h。用10 mmol/L PBS反復(fù)清洗，以除去未反應(yīng)的cDNA/DNA1-AuNPs；最后，電極表面用高純氮?dú)獯蹈桑瑢?0 μL 50 μmol/L的釕胺溶液滴加到電極表面，靜電吸附平衡10 min后進(jìn)行電化學(xué)測(cè)定。

1.5 電化學(xué)測(cè)定

所有電化學(xué)檢測(cè)均在CHI 660C型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司，上海）上進(jìn)行，采用三電極體系：金電極為工作電極、鉑電極為對(duì)電極、KCl飽和的飽和甘汞電極（SCE）為參比電極。計(jì)時(shí)電量測(cè)定前將電極浸入測(cè)量底液中允許釕胺嵌入富集10 min，測(cè)量底液是：50 μmol/L釕胺溶液 （10 mmol/L Tris-HCl，pH7.4）， 測(cè)量前通入高純氮?dú)?5 min以除去溶解氧；交流阻抗測(cè)定底液 是 ： 5.0 mmol/L Fe(CN)63-/4-（10 mmol/L PBS，pH7.3，0.1 mol/L KCl）。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。首先，將巰基DNA1修飾到金電極上作為捕獲探針，當(dāng)目標(biāo)DNA存在時(shí)就會(huì)形成巰基DNA1、目標(biāo)DNA與DNA2-AuNPs的“三明治”雜交結(jié)構(gòu)。由于每個(gè)金納米顆粒上修飾有多條DNA序列，可以通過(guò)靜電吸附作用結(jié)合大量的釕胺分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的第一次放大檢測(cè)。然后，將cDNA/DNA1-AuNPs滴加到金電極表面，就會(huì)形成DNA2-AuNPs、cDNA與DNA1-AuNPs的第二個(gè) “三明治”雜交結(jié)構(gòu)。電極表面形成的這種DNA功能化納米金顆?！皹?shù)枝”狀結(jié)構(gòu)能結(jié)合更多的釕胺分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的二次放大檢測(cè)。

圖1 功能化納米金顆?！皹?shù)枝”狀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)信號(hào)的方法檢測(cè)DNA的原理圖Fig.1 Schematic illustration of the dendritic amplification electrochemical biosensor

2.2 巰基DNA修飾的納米金顆粒的表征

采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)表征了納米金顆粒修飾巰基DNA前后的吸收光譜變化。由檸檬酸三鈉還原法制備的納米金顆粒，其最大吸收波長(zhǎng)為518 nm，可推測(cè)其粒徑約為13 nm[11]。經(jīng)巰基DNA修飾后，溶液的最大吸收波長(zhǎng)紅移至524 nm，說(shuō)明巰基DNA已修飾到納米金顆粒上。根據(jù)文獻(xiàn)[13]可知納米金顆粒濃度約為2.5 nmol/L。

2.3 可行性考察

分別采用計(jì)時(shí)電量法和交流阻抗法對(duì)該方法的可行性進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖2、3所示。圖2為利用計(jì)時(shí)電量方法考察的結(jié)果。其中曲線(xiàn)a為巰基己醇修飾電極的計(jì)時(shí)電量曲線(xiàn)，修飾SHDNA1電極的計(jì)時(shí)電量響應(yīng)如曲線(xiàn)b，根據(jù)文獻(xiàn)[14]可計(jì)算電極表面修飾密度約為5.2×1012分子/cm2。加入0.1 nmol/L cDNA和DNA2-AuNPs后，計(jì)時(shí)電量響應(yīng)由曲線(xiàn)b變化為曲線(xiàn)c，響應(yīng)信號(hào)有明顯增強(qiáng)，這是由于固定在電極表面的SHDNA2-AuNPs可嵌入的釕胺分子數(shù)量增多所致。當(dāng)加入cDNA/DNA1-AuNPs后，計(jì)時(shí)電量響應(yīng)由曲線(xiàn)c化為曲線(xiàn)d，響應(yīng)信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，說(shuō)明在電極表面形成了“樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)之后，其嵌入的釕胺分子數(shù)量進(jìn)一步增加，從而引起電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)。

圖2 傳感器檢測(cè)DNA可行性考察的計(jì)時(shí)電量曲線(xiàn)圖（a）MCH 修飾的電極；（b）SH-DNA1/MCH 修飾的電極；（c）加入0.1 nmol/L cDNA，基于納米金顆粒放大后的計(jì)時(shí)電量曲線(xiàn)；（d）基于功能化納米金顆?！皹?shù)枝”狀結(jié)構(gòu)放大后的計(jì)時(shí)電量曲線(xiàn)Fig.2 Chronocoulometry responses of the electrochemical biosensor(a)MCH modified gold electrode;(b)SH-DNA1 and MCH modified gold electrode;(c)after treatment with Au nanoparticles amplification;(d)after treatment with dendritic amplification.The concentration of cDNA was 0.1 mol/L

圖3 法拉第阻抗圖譜（a）裸電極；（b）巰基 DNA1 和 MCH 修飾的金電極；（c）加入0.1 nmol/L cDNA，基于納米金顆粒放大后的交流阻抗曲線(xiàn)；（d）基于功能化納米金顆粒“樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)放大后的交流阻抗曲線(xiàn)Fig.3 Faradic impedance spectra(a)of the bare gold electrode;(b)of SH-DNA1 and MCH modified gold electrode;(c)after treatment with Au nanoparticles amplification;(d)after treatment with dendritic amplification.The concentration of cDNA was 0.1 mol/L

然后采用阻抗法進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3所示。其中a為裸金電極的法拉第阻抗圖譜，其阻抗R很?。≧=138.1 Ω）。當(dāng)金電極表面修飾了巰基探針并用MCH封閉后，其阻抗R增大至1 588 Ω，這是由于電極表面形成了一層致密的分子層所致。當(dāng)加入0.1 nmol/L cDNA與DNA2-AuNPs后，其阻抗值增加到2 559 Ω（如曲線(xiàn)c所示），這是由于電極表面形成“三明治”結(jié)構(gòu)，電極表面引入更多的負(fù)電荷，進(jìn)而對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)中的Fe(CN)63-/4-產(chǎn)生靜電排斥作用所致；當(dāng)加入cDNA/DNA1-AuNPs后，其阻抗值進(jìn)一步增大至4 660 Ω（如曲線(xiàn)d所示），這是由于在電極表面形成了“樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)，電極表面引入的負(fù)電荷進(jìn)一步增加，導(dǎo)致阻抗值也隨之增加。

2.4 目標(biāo)DNA的定量檢測(cè)

利用計(jì)時(shí)電量法檢測(cè)了一系列不同濃度的目標(biāo)DNA分子，如圖4A所示?？梢钥闯鲭S著目標(biāo)DNA濃度的提高，計(jì)時(shí)電量信號(hào)逐步增強(qiáng)。以表面吸附釕胺發(fā)生還原反應(yīng)所需的法拉第電量增量ΔQ對(duì)目標(biāo)DNA濃度作圖，得到兩者之間的關(guān)系如圖4B所示。 其中 ΔQ=Q1-Q2，Q1為目標(biāo)DNA存在時(shí)的電量值，Q2為cDNA不存在時(shí)的計(jì)時(shí)電量值。圖4B插圖 為對(duì)應(yīng)的電量濃度對(duì)數(shù)曲線(xiàn)。用納米金顆粒放大的方法對(duì)目標(biāo)DNA的線(xiàn)性回歸方程為ΔQ＝30.64Log(c)+398.15，相關(guān)系數(shù)為0.96，檢測(cè)下限為0.52 pmol/L。“樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)放大的線(xiàn)性回歸方程為ΔQ＝42.0 Log(c)+556.15，相關(guān)系數(shù)為0.98，檢測(cè)下限為0.13 pmol/L，使檢測(cè)限降低了4倍。

圖4 不同濃度目標(biāo)cDNA對(duì)應(yīng)的的計(jì)時(shí)電量圖(A).不同濃度cDNA對(duì)應(yīng)的計(jì)時(shí)電量響應(yīng)曲線(xiàn)，從上到下cDNA的濃度依次是10 000、5 000、1 000、100、10、1、0.5、0.1、0 pmol/L；(B)工作曲線(xiàn)。插圖 為電量增量與cDNA濃度對(duì)數(shù)值的關(guān)系曲線(xiàn)，其中，a是用納米金顆粒放大的響應(yīng)曲線(xiàn)；b是用“樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)放大的響應(yīng)曲線(xiàn)Fig.4 Chronocoulometry curves for electrodes with capture probe hybridized with target DNA at a series of concentrations(A).The concentration of cDNA was 0,0.1 pmol/L,0.5 pmol/L,1 pmol/L,10 pmol/L,0.1 nmol/L,1 nmol/L and 10 nmol/L,respectively.(B)Calibration plots of target DNA detection:(a)after treatment with Au nanoparticles amplification;(b).after treatment with dendritic amplification

2.5 選擇性的考察

圖5 選擇性Fig.5 Selectivity

考察了該方法對(duì)含錯(cuò)配位點(diǎn)序列的選擇性。結(jié)果如圖5所示。其中目標(biāo)DNA濃度均為0.1 nmol/L?？梢钥闯觯捎谩皹?shù)枝”狀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)信號(hào)的電化學(xué)傳感器檢測(cè)時(shí)，smDNA所引起的計(jì)時(shí)電量響應(yīng)信號(hào)是cDNA的23%，dmDNA所引起的計(jì)時(shí)電量響應(yīng)信號(hào)是cDNA的12%，隨機(jī)DNA所引起的計(jì)時(shí)電量響應(yīng)信號(hào)是cDNA的6%。而采用納米金顆粒增強(qiáng)信號(hào)的電化學(xué)傳感器檢測(cè)時(shí)，smDNA、dmDNA和隨機(jī)DNA所引起的計(jì)時(shí)電量響應(yīng)信號(hào)分別是cDNA的28%、16%和8%。因此，相對(duì)僅用納米金顆粒增強(qiáng)信號(hào)的電化學(xué)傳感器檢測(cè)而言，“樹(shù)枝”狀結(jié)構(gòu)增強(qiáng)信號(hào)的電化學(xué)傳感器的堿基錯(cuò)配識(shí)別能力略有提高。

3 小結(jié)

構(gòu)建了一種基于核酸適體和金納米顆?！皹?shù)枝”狀信號(hào)放大檢測(cè)核酸分子雜交的電化學(xué)生物傳感器。該傳感器對(duì)DNA分子檢測(cè)下限達(dá)到了0.13 pmol/L，對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)具有高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，有望拓展到小分子或其他目標(biāo)物的檢測(cè)中。

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