王海軍，袁 若，柴雅琴

（西南大學化學化工學院，重慶400715）

0 引言

電致化學發(fā)光 （ECL）主要是通過電化學手段，利用檢測體系中某些化合物在電極表面通過電子遷移反應生成不穩(wěn)定的激發(fā)中間態(tài)，當激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時產(chǎn)生光輻射[1～2]。ECL最近成為了一種重要的，并且受到很大關注的檢測方法，這是由于ECL具有簡單、快速、高靈敏等優(yōu)點。Ru(bpy)32+、魯米諾（luminol）和量子點是三種常見的發(fā)光試劑。然而，基于這些常見的發(fā)光試劑的生物分析有一些局限性：Ru(bpy)32+的多位點標記會降低生物分子的活性，luminol在接近體液環(huán)境的條件下光信號很低，量子點用于生物分析的靈敏度非常低。因此，探索新型的ECL體系應用于免疫分析是非常必要的。Koval’chuk工作小組曾經(jīng)觀察到S2O82-水溶液的發(fā)光現(xiàn)象，并提出其可能的反應機理[3]。然而，大量的工作集中于研究S2O82-水溶液的發(fā)光機理，由于其發(fā)光信號較低，將S2O82-水溶液這一發(fā)光體系應用于免疫分析的報道非常少。所以，將S2O82-水溶液應用于免疫分析首要解決的問題是增強其光信號，提高反應靈敏度。

甲胎蛋白（AFP）是國際公認的腫瘤標志物，可用于診斷肝癌，當AFP含量高于20 ng/mL即可懷疑為肝癌[4]。據(jù)統(tǒng)計，健康成人體內(nèi)AFP的平均含量低至3.4 ng/mL，肝癌病人體內(nèi)AFP含量為4.2～57.5 ng/mL[4]。因此，為了滿足臨床診斷需要，AFP的檢測方法應當具有寬線性范圍和高靈敏度。

在此工作中，構(gòu)建了新型的基于S2O82-水溶液的ECL免疫傳感器，磷酸緩沖液（PBS）配制的S2O82-溶液作為檢測底液。首先，在玻碳電極表面沉積一層納米金，通過納米金與生物分子之間的特殊作用將抗體修飾于電極表面。當抗體吸附于納米金表面修飾于電極上，牛血清白蛋白（BSA）用于封閉非特異性位點，防止非特異性吸附。孵育上抗原AFP之后，將由L-cys，HPtPd和GOD制成的的二抗修飾于電極表面從而構(gòu)建超靈敏的ECL免疫傳感器。在L-cys，HPtPd和原位生成共反應試劑的共同催化下，該傳感器的線性檢測范圍為0.000 1～100 ng/mL，檢測限為33 fg/mL。實驗結(jié)果顯示該免疫傳感器制備過程簡單，靈敏度高，線性范圍寬。因此，該文為ECL免疫分析開辟了一片新領域。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

甲胎蛋白抗體（anti-AFP）和抗原（AFP）（鄭州博賽生物技術研究所）；L-cys、K2S2O8(上?？颠_氨基酸廠）；氯金酸、氯鉑酸、牛血清白蛋白（BSA 96%～99%）(Sigma 公 司)； K2PdCl4、 硼 氫 化 鈉（NaBH4）（百靈威科技有限公司）；磷酸緩沖溶液（PBS，0.1mol/L，pH7.4） 是由 0.1 mol/L Na2HPO4,0.1 mol/L KH2PO4和 0.1 mol/L KCl混合配制而成；其他試劑均為分析純試劑，實驗用水為二次蒸餾水。

MPI-A型電致化學發(fā)光分析系統(tǒng)（西安瑞邁分析儀器有限公司）（光電倍增管高壓800 V），透射電子顯微鏡 (TEM，H600，日本 Hitachi Instrument公司)，X 射線光電子能譜 （XPS）(美國Thermoelectricity Instruments公司)，MP230酸度計 （瑞士 Metter Toledo公司），BRANSONIC 200超聲清洗儀（德國BRANSON ULTRASCHALL公司）。實驗過程采用三電極系統(tǒng)，玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，Pt絲電極為對電極。

1.2 二抗(L-cys-HPtPd)n-GOD-Ab2的制備

圖1所示為二抗的制備過程。首先，HPtPd納米粒子按照文獻[5]合成，圖1的插圖 為該復合納米粒子的TEM表征圖。然后在攪拌下將該納米粒子緩慢地加入2mL pH=2.3的L-cys溶液中，然后持續(xù)反應12 h。由于L-cys分子結(jié)構(gòu)中巰基和氨基與HPtPd納米粒子的特殊作用，此二者可以在溶液中層層自組裝，形成(L-cys-HPtPd)n復合物。離心之后所得離出物分散于1mL PBS溶液中。然后在 (L-cys-HPtPd)n復合物上修飾上Ab2，并用GOD封閉非特異性結(jié)合位點，離心后分散于1mL PBS中待用。

圖1 (L-cys-HPtPd)n-GOD-Ab2的制備過程示意圖，插圖 為HPtPd的TEMFig.1 The preparation procedure of(L-cys-HPtPd)n-GOD-Ab2bioconjugate.Inset:TEM image of HPtPd nanochains

1.3 夾心結(jié)構(gòu)的免疫傳感器的制備

將玻碳電極分別用0.3和0.05 μm的Al2O3粉在麂皮上打磨拋光處理成鏡面，依次用乙醇和蒸餾水超聲清洗，清洗后的電極置于室溫下晾干。

如圖2所示，首先將預處理的玻碳電極浸入5mL HAuCl4（1%）的溶液中，在-0.2 V恒電位下沉積30 s，在電極表面形成一層均勻的納米金層；然后將納米金修飾的玻碳電極浸入AFP抗體溶液中，在4℃孵育12 h；接著在4℃條件下將電極浸入BSA（96%～99%）溶液中1 h，封閉非特異性吸附位點；隨后孵育10 ng/mL AFP抗原，利用抗體抗原的特異性結(jié)合，將抗原修飾到電極表面；最后浸入制備好的二抗中，孵育20 min。

圖2 傳感器的制備過程及反應機理示意圖Fig.2 Schematic diagram of preparation and reaction mechanism of the ECL immunosensor

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器制備過程的ECL表征

通過測定修飾電極在濃度為0.1 mol/L的S2O82-溶液中ECL強度的變化可以表征傳感器的制備過程，如圖3所示。裸電極在S2O82-溶液產(chǎn)生一個較低的ECL信號（曲線a），據(jù)文獻報道，它主要是S2O82-水溶液的發(fā)光。由于金納米粒子可以促進電子傳遞，所以當裸電極上沉積納米金之后，修飾電極的ECL信號有了很大的提高(曲線b)。但是，當抗體修飾到電極表面時，ECL信號有明顯的降低(曲線c)，這是因為蛋白質(zhì)阻礙電子的傳遞并且也阻礙了發(fā)光試劑向電極表面的擴散。同樣，當BSA和抗原修飾到電極上的時候，ECL信號進一步降低(曲線d和e)。但是，當二抗(L-cys-HPtPd)n-GOD-Ab2修飾到電極上時，ECL信號有很大的增高 (曲線f)。這是由于二抗上的L-cys和 HPtPd都對S2O82-的 ECL有很強的催化。同時，向底液中加入適量葡萄糖時，ECL強度進一步提高(曲線g)，其原因是GOD和HPtPd協(xié)同催化原位產(chǎn)生O2，極大地增加了電極表面溶解氧的局部濃度，從而大大地提高了靈敏度。

圖3 傳感器制備過程的ECL表征Fig.3 ECL characterization of the electrochemiluminescence immunosensor

2.2 目標抗原AFP的測定

在最優(yōu)條件下，探究了該傳感器檢測目標抗原AFP的性能。圖4所示為該傳感器的ECL強度隨抗原濃度的對數(shù)值變化的線性關系。其線性方程為I=8 688.6+1 387.6 log c (其中 I表示ECL強度，c表示AFP的濃度)，相關系數(shù)為0.997 1。該標準曲線的線性范圍為0.000 1 ng/mL到100 ng/mL，檢出限為33 fg/mL?；谏鲜鼍€性關系可知該傳感器有良好的性能，可以很好地應用于AFP的檢測，以及推廣到其他分析檢測領域。

圖4 傳感器的工作曲線Fig.4 Calibration curve of the modified GCE responding to different concentration of AFP

2.3 傳感器的應用

為了評估所構(gòu)建的免疫傳感器在臨床診斷的可行性，用標準添加的方法做了回收率實驗，即用稀釋的人體血清溶液配制了不同濃度的AFP抗原溶液。檢測結(jié)果顯示回收率為90.8%～103.1%（如表1所示），在可接受的范圍內(nèi)，說明該免疫傳感器在臨床診斷中具有一定的實際應用價值。

表1 傳感器的加標回收試驗Tab.1 Determination of AFP added in normal human serum with the proposed immunosensor

3 結(jié)論

該實驗通過新型的信號放大策略制備了S2O82-的超靈敏免疫傳感器。該傳感器有以下幾個特點：(1)通過L-cys和HPtPd納米鏈的層層自組裝極大地增加了 L-cys，HPtPd及 GOD的固載量；(2)利用HPtPd能夠催化H2O2分解的特性，設計了GOD及HPtPd的仿雙酶結(jié)構(gòu)，原位生成共反應試劑催化S2O82-的電致化學發(fā)光。基于上述設計，該傳感器展現(xiàn)出了很寬的線性范圍和極低的檢出限，能很好地應用于分析檢測領域。

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[2]Chen Y, Mao F, Liu C H.[Ru(dpp)3][(4-Clph)4B]2Nanoislands Directly Assembled on an ITO Electrode Surface and Its Electrogenerated Chemiluminescence[J].Langmuir,2009,25:1 253～1 258.

[3]Reshetnyak O V,Koval`chuk E P,Skurski P,et al.The origin of luminescence accompanying electrochemical reduction or chemical decomposition of peroxydisulfates[J].J.Lumin.,2003,105:27～34.

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[5]Zhai J F,Huang M H,Zhai Y M,et al.Magnet-assisted assembly of 1-dimensional hollow PtCo nanomaterials on an electrode surface[J].J.Mater.Chem.,2008,18:923～928.