仇曉雯，夏云峰，徐清皓，甘思文，黃杉生

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海200234）

0 引言

類(lèi)似于基于蛋白質(zhì)的抗體,適配體是基于核酸的分子,用于選擇性地結(jié)合與其有特異性吸附的分子的識(shí)別[1～2]。然而，相對(duì)于抗體識(shí)別目標(biāo)物分子而言，適配體有很多的優(yōu)勢(shì)，比如通過(guò)SELEX技術(shù)體外篩選、選擇性合成并富集，它們?nèi)菀仔揎?，穩(wěn)定性較高，容易儲(chǔ)存，且不易發(fā)生變異和降解，并且對(duì)于目標(biāo)物分子檢測(cè)種類(lèi)廣泛[3]。這些突出的性質(zhì)使得適體成為生物檢測(cè)以及臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域中理想的蛋白識(shí)別體，通過(guò)熒光分析[4～5]，比色方法[6～7]，微型比重分析[8]，石英微天平[9]，電化學(xué)方法[10～13]等。

相對(duì)其它分析方法，電化學(xué)適體傳感器制備簡(jiǎn)便，易修飾，穩(wěn)定性好和結(jié)合目標(biāo)范圍廣等。適體傳感器已越來(lái)越多地運(yùn)用于各種物質(zhì)的檢測(cè)[14～15]。

該文選擇具有良好導(dǎo)電性和生物相容性地石墨烯作為電極的基底材料，通過(guò)簡(jiǎn)單可控的電沉積法富集金納米粒子，在金納米粒子共價(jià)連接帶有巰基的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中含有一根標(biāo)記有二茂鐵甲酸作為電活性物質(zhì)的適體探針鏈。區(qū)別于常見(jiàn)的通過(guò)目標(biāo)物蛋白與適配體之間的特異性集合，導(dǎo)致單鏈DNA構(gòu)型的改變進(jìn)而引起電活性物質(zhì)與電極表面距離的改變[16]，最終引起的響應(yīng)電流增強(qiáng)或衰減。該文的特別之處在于選擇二茂鐵甲酸修飾在適體探針鏈靠近電極表面的一端，使得相應(yīng)電流得到一定程度的增強(qiáng)，一旦目標(biāo)物蛋白結(jié)合導(dǎo)致適體探針鏈打開(kāi)，部分標(biāo)記物離開(kāi)電極，直接導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)的衰減。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)檢測(cè)在CHI660C電化學(xué)工作站(上海辰華，中國(guó))上完成；電化學(xué)裝置為傳統(tǒng)的三電極體系：玻碳電極作為工作電極，飽和甘汞電極和鉑絲電極分別用作參比電極和對(duì)電極；電極修飾層形貌的掃描電鏡圖用S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Hitachi，日本）測(cè)定；DNA雙鏈的退火是用PCR儀器AG22331(Eppendorf,德國(guó))完成。

天然石墨粉（大小≤30 μm）,硝酸，硫酸，氯酸鉀，乙醇，肼，過(guò)氧化氫（H2O2），由上?；瘜W(xué)試劑公司提供；氯金酸（HAuCl4）、二茂鐵甲酸（Fc）、萘酚（nafion）、Tris-HCl、Ru(NH3)6Cl3及退火 buffer購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上海分公司；1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺（NHSS）均購(gòu)于上海阿拉丁試劑；溶菌酶（Lysozyme）購(gòu)于 Amresco(美國(guó))公司；磷酸鹽緩 沖 溶 液 （PBS，pH=7.4）由 0.1 mol/L KCl、Na2HPO4、NaH2PO4配制。實(shí)驗(yàn)中所用試劑均為分析純，所用的水是Milli-Q18.2 MΩ水。

寡聚核苷酸序列由上海生工生物工程公司合成：

固定鏈序列 （comDNA）：5'-GAT GAA TTC GTA GAT-SH-3'

適體探針鏈序列（aptDNA）：5'-NH2-(CH2)6–ATC TAC GAA TTC ATC AGG GCT AAA GAG TGC AGA GTT ACT TAG-3'

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 石墨烯的制備及羧基化

石墨烯參照文獻(xiàn)[17]所述方法制備。簡(jiǎn)單地說(shuō)，在硝酸和硫酸的溶液中，石墨粉先用氯酸鉀氧化120 h。石墨氧化后，加入過(guò)量的水至混合物中，用5%的鹽酸溶液沖洗，然后重復(fù)用水沖洗直到pH值為中性。然后將氧化態(tài)的石墨分散在乙醇和水的混合溶液中，超聲1 h。分層后，氧化態(tài)石墨用肼還原20 h，形成石墨烯片。最后，石墨烯片經(jīng)離心、洗滌、真空干燥后，使之帶有羥基和羧基。圖1為成功合成的石墨烯透射電鏡圖。

圖1 石墨烯的透射電鏡圖Fig.1 FE-TEM image of graphene

石墨烯的改性在文獻(xiàn)報(bào)道的方法上稍作一些改進(jìn)。石墨烯在超聲協(xié)助下進(jìn)行混酸處理4 h，混酸由硫酸和硝酸（體積比3∶1）組成，溫度控制在70℃的水中超聲，再用過(guò)氧化氫 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）溶液處理2 h。棄去濾液，羧基化石墨烯用水沖洗直至中性后干燥。通過(guò)傅里葉變換紅外光譜分析（圖2），由在1 700 cm-1波長(zhǎng)處可以斷定這種氧化處理方法可以在石墨烯表面產(chǎn)生—COOH基團(tuán)。

圖2 羧基化的石墨烯紅外譜圖Fig.2 FT-IR image of carboxylic graphene

1.2.2 電極的制備

玻碳電極 （Φ =3 mm）分別用 1.0、0.3、0.05 μm的氧化鋁粉末拋光，直至產(chǎn)生一個(gè)光亮、平滑的表面。電極分別置于超純水，無(wú)水乙醇、超純水里超聲清洗3 min后，用氮?dú)鈱⑵浔砻娲蹈伞? mg的氧化石墨烯分散于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%nafion溶液中，超聲0.5 h，取4 μL該溶液滴涂于玻碳電極表面，在空氣中晾干，形成一層氧化石墨烯萘酚復(fù)合膜，用水沖洗晾干，得到的電極記作為GO/GCE。然后將GO/GCE浸入1 mmol/L的HAuCl4溶液中，采用循環(huán)伏安法，電位設(shè)定在-0.1～-0.3 V，掃速為 0.1 V/s，電沉積 300 s，用雙蒸水沖洗，得到AuNPs/GO/GCE修飾電極。

修飾電極的最后一個(gè)步驟是dsDNA的固定。 首先取 comDNA (50 μmol/L)20 μL、aptDNA(60 μmol/L)25 μL、10 μL 退火 buffer(100 mmol/L Tris+1 mol/L NaCl+0.5 mol/L EDTA pH=7.4)、45 μL水共100 μL液體置于PCR儀中，采用程序升溫并退火，使其在95℃下恒溫10 min，并且以1℃/min的速率降至室溫，得到穩(wěn)定的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，最終comDNA及aptDNA的濃度分別為10 μmol/L、15 μmol/L，保存于 4 ℃冰箱里。

為了避免產(chǎn)生不穩(wěn)定的中間體，我們選用二茂鐵甲酸(Fc)23 mg(0,1 mmol/L)、1-乙基-3-（3-二甲基氨丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)23 mg(0.12 mmol/L)、N-羥基琥珀酰亞胺 （NHSS）32 mg(0.15 mmol/L)溶解于 10 mL無(wú)水 DMF溶液中，密封置于冰箱1 h使其充分活化。

取 6 μL dsDNA退火液滴涂于 AuNPs/GO/GCE表面，通過(guò)Au-S鍵將其組裝至電極上，密封常溫下放置 20 h，用 PBS（pH=7.4）溶液沖洗表面，以除去物理吸附的物質(zhì)。然后取20 μL活化后的二茂鐵甲酸DMF混液滴于電極上，密封凍存3～4 h，使二茂鐵甲酸共價(jià)標(biāo)記于適體探針鏈含氨基的5’端，再用PBS沖洗干凈，最后在電極表面滴上 20 μL 10 mmol/L 的巰基己醇，0.5 h 后洗去，得到修飾成功的dsDNA/AuNPs/GO/GCE電極?；谘趸?金納米粒子放大電信號(hào)的二茂鐵標(biāo)記型溶菌酶適體傳感器如圖3所示。

1.2.3 目標(biāo)物溶菌酶的孵化和電化學(xué)測(cè)定

圖3 基于氧化石墨烯/金納米粒子放大電信號(hào)的二茂鐵標(biāo)記型溶菌酶適體傳感器原理圖Fig.3 Schematic of aptamer based on carboxylic graphene and Au nanoparticles for detection of lysozyme

通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，最終選擇適體DNA鏈和溶菌酶的特異性結(jié)合選擇溫度為37℃，將dsDNA/AuNPs/GO/GCE浸入在含不同濃度的溶菌酶（PBS,pH=7.4）溶液中反應(yīng)約1 h時(shí)間。之后用PBS溶液洗去未發(fā)生結(jié)合的溶菌酶。

反應(yīng)后的電極以底液 PBS（0.1 mol/L,含 KCl,pH7.4）進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試，示差脈沖伏安法（DPV）的測(cè)定從 0.6 V～0.0 V，脈沖廣度為 0.1 V,脈沖寬度為0.05 S。此時(shí)，二茂鐵甲酸的特征還原峰電位在 0.25 V 處，峰電流在 1～10 μA 范圍內(nèi)。

2 結(jié)果和討論

2.1 電極表面膜的掃描電鏡圖

2.1.1 電極表面修飾氧化石墨烯萘酚膜的FESEM表征

以場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）表征了在電極表面的氧化石墨烯萘酚膜的形貌 （圖4）。從圖4（左）中可以看出，電極表面有許多的層狀的氧化石墨烯。放大至4（右）圖，石墨烯單層的帶有褶皺的結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，由此說(shuō)明萘酚作為溶劑對(duì)于石墨烯在電極表面的固定非常好。并且大大提高了電極的表面積，為金納米粒子的生長(zhǎng)提供了更多的平臺(tái)。

圖4 固定有氧化石墨烯萘酚膜的玻碳電極FE-SEM圖（左）和放大后的氧化石墨烯層狀結(jié)構(gòu)FE-SEM圖（右）Fig.4 FE-SEM of Oxidized grapheme-Nafion film coated on glaasy carbon electrode(left)and magnification of it(right)

2.1.2 氧化石墨烯電極沉積金納米粒子后的FE-SEM表征

通過(guò)固定程序的伏安法將氯金酸中金離子還原為單質(zhì)，電極表面形貌發(fā)生了很大變化（圖5）。通過(guò)圖5（左）可以看出，金納米粒子均勻的生在于氧化石墨烯的片層表面之上，而圖5（右）為放大后金納米粒子，經(jīng)過(guò)測(cè)量統(tǒng)計(jì)，金納米粒子的直徑在20～30 nm范圍內(nèi)，并形成團(tuán)簇。

圖5 沉積金后的氧化石墨烯電極（左）和放大后的金納米粒子（右）Fig.5 FE-SEM of Au nanoparticles electro-deposition on GO/GCE(left)and magnification of it(right)

2.2 dsDNA/AuNPs/GO/GCE電極電化學(xué)表征

2.2.1 修飾電極的交流阻抗表征

圖6描繪了不同修飾層的電化學(xué)交流阻抗圖，底液選擇在 10 mmol/L Fe(CN)63-/4-（0.1 mol/L KNO3）進(jìn)行。 參數(shù)設(shè)置為：頻率從 0.05 Hz到10 KHz，ac激發(fā)振幅為5 mV。發(fā)現(xiàn)當(dāng)玻碳電極經(jīng)氧化石墨烯萘酚膜修飾后(曲線b)，阻抗由原來(lái)的裸電極 200 Ω(曲線 a)變?yōu)?1500 Ω 左右，其原因可能是萘酚作為一種有機(jī)溶劑有較大的電阻。然而萘酚的使用有利于氧化石墨烯在電極表面的固定。當(dāng)金納米粒子沉積成功后(曲線c)，由于納米金良好的導(dǎo)電性能以及較高的比表面積，阻值減小到80 Ω以內(nèi)，導(dǎo)電性強(qiáng)于裸的玻碳電極。說(shuō)明金作為一種極好的導(dǎo)電物質(zhì)，大大促進(jìn)了Fe(CN)63-/4-之間電子的遷移。當(dāng)含有適體探針鏈的雙鏈DNA修飾上電極之后(曲線d)，阻值再次增大至 750 Ω，遠(yuǎn)大于 80 Ω，這表明 dsDNA的共價(jià)固定是成功的，并由于雙鏈DNA自身的磷酸骨架帶一定量的負(fù)電荷，阻礙了電子之間的遷移。

圖6 不同修飾層電極的阻抗譜圖GCE（a）、GO/GCE(b)、AuNPs/GO/GCE(c)、dsDNA/PdNPs/GO/GCE（d）在 10 mmol/L Fe(CN)63-/4-（0.1 mol/L KNO3）溶液中的電化學(xué)阻抗圖Fig.6 The EIS image of different layers modified electrodes

2.2.2 計(jì)時(shí)庫(kù)倫—電化學(xué)有效表面積的測(cè)定

裸玻碳電極、AuNPs/GCE、AuNPs/GO/GCE修飾電極的電化學(xué)有效表面積可以利用計(jì)時(shí)庫(kù)侖法，通過(guò)Anson公式計(jì)算出來(lái)[18～19]:

上面式中，A為工作電極的電化學(xué)有效表面積，c為底物濃度，D為擴(kuò)散系數(shù)，Qdl是雙電層電荷（可通過(guò)背景扣除），Qads是法拉第電荷。我們將Q與t1/2線性擬合，得到斜率值。若n、c、D已知，則A值即可通過(guò)計(jì)算獲得。

計(jì)時(shí)庫(kù)侖法實(shí)驗(yàn)是在含有0.1 mmol/L K3[Fe(CN)6]（0.1 mmol/L KCl）溶 液 中 進(jìn) 行 的 （圖7）。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，K3[Fe(CN)6]的擴(kuò)散系數(shù)為7.6×10-6cm2/s[20]。

圖7 GCE、AuNPs/GCE、AuNPs/GO/GCE 在 0.1 mmol/L K3[Fe(CN)6]（含有 0.1 mmol/L KCl）中的計(jì)時(shí)庫(kù)侖圖Fig.7 Chronocoulometry image of diferrent modified layers modified electrode

圖8 GCE、AuNPs/GCE、AuNPs/GO/GCE Q 與 t1/2線性關(guān)系圖Fig.8 Linear relationship image of coulomb to t1/2

通過(guò)圖8并進(jìn)行計(jì)算，得到裸玻碳電極、金納米電極、金納米氧化石墨烯電極的有效表面積大小 分別為 0.000 48 cm2、0.001 2cm2和 0.004 5 cm2。這可能是由于氧化石墨烯帶有褶皺的層狀結(jié)構(gòu)，為金納米粒子的生長(zhǎng)提供了較大的表面積，而金本身有較多的活性位點(diǎn)，為下一步中帶有巰基的雙鏈DNA雙鏈的固定提供了更大的效率。此外，電極的有效表面積越大，則說(shuō)明電極表面修飾的物質(zhì)活性越好，進(jìn)而電極響應(yīng)越靈敏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明修飾氧化石墨烯和金納米粒子成功后，電極有效表面積大大增加，電流響應(yīng)和靈敏度也明顯得到相應(yīng)地提高。

2.3 溶菌酶檢測(cè)條件的優(yōu)化

溶菌酶與適體探針鏈的特異性結(jié)合與時(shí)間及溫度密切相關(guān)。溫度過(guò)低時(shí)，溶液中的溶菌酶擴(kuò)散速率緩慢，需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間；如果溫度高于DNA的解鏈溫度時(shí)（Tm=67℃），電極上固定的dsDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，則標(biāo)記有活性分子二茂鐵甲酸的適體探針鏈會(huì)相應(yīng)減少，導(dǎo)致電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的減弱。該實(shí)驗(yàn)最終選擇反應(yīng)溫度在37℃。此外，分析測(cè)定的持續(xù)時(shí)間和靈敏度也受溶菌酶反應(yīng)時(shí)間的影響，隨著結(jié)合時(shí)間的推移，溶菌酶與適體探針鏈的特異性結(jié)合效率持續(xù)升高，直至1 h后，基本保持穩(wěn)定，所以該實(shí)驗(yàn)選擇溶菌酶反應(yīng)時(shí)間為1 h。

2.4 初步應(yīng)用

2.4.1 濃度信號(hào)關(guān)系曲線

dsDNA/AuNPs/GO/GCE修飾電極的DPV響應(yīng)隨著溶菌酶濃度的增加而持續(xù)衰減（圖9）。對(duì)每一個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行三次平行測(cè)定，取平均值并計(jì)算其誤差，通過(guò)非線性擬合得到如圖10的DPV電流相應(yīng)值對(duì)目標(biāo)物溶菌酶的關(guān)系圖。方程為Ip.c(μА)=5.76×10-4c-0.29(c是目標(biāo)物溶菌酶的濃度，mol/L;Ip.c是電極的還原峰電流，μA;)，曲線的回歸系數(shù)為0.997 8，該電極對(duì)于溶菌酶的檢出限是6.02×10-12mol/L。

圖9 dsDNA/AuNPs/GO/GCE孵化了不同濃度（mol/L）溶菌酶后的DPV響應(yīng)圖:(a)0(b)1.08×10-11(c)1.082×10-10(d)1.08×10-9(e)1.08×10-8Fig.9 DPV response of the dsDNA/AuNPs/GO/GCE incubated with increasing concentration of lysozyme

圖10 DPV電流對(duì)相應(yīng)溶菌酶濃度的標(biāo)準(zhǔn)非線性擬合曲線Fig.10 the nonlinear calibration curve of the aptamer

2.4.2 干擾物實(shí)驗(yàn)

考察了dsDNA/AuNPs/GO/GCE傳感器對(duì)于溶菌酶檢測(cè)的特異性，選擇免疫球蛋白（IgG）、細(xì)胞色素 C（CytC）、牛血清蛋白（BSA）、牛血紅蛋白（Bhb）這幾種非特異性吸附的蛋白物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，與被測(cè)物溶菌酶進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果示于圖11。測(cè)定的各種蛋白濃度均在相同數(shù)量級(jí)，其中C(Lysozyme)=1.08×10-8,C(IgG)=3.33×10-8,C(CytC)=1.0×10-8, C(BSA)=1.0×10-8, C(Bhb)=1.0×10-8(mol/L)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然對(duì)于溶菌酶的檢測(cè)存在一定程度的干擾，但是相對(duì)于其目標(biāo)物本身而言，干擾物的影響并不高，因此該適體傳感器的特異性較好。

3 結(jié)論

圖11 dsDNA/AuNPs/GO/GCE傳感器對(duì)于目標(biāo)物L(fēng)ysozyme及 IgG、CytC、BSA、Bhb電流衰減度比對(duì)圖Fig.11 the signal suppression of the aptamer after it reacted with lysozyme and other interferents

基于氧化石墨烯為基底的金納米粒子放大信號(hào)的標(biāo)記型傳感器檢測(cè)溶菌酶，方法簡(jiǎn)單快捷，石墨烯的生物相容性和金納米的出色導(dǎo)電性和大的表面積進(jìn)一步提高了電活性物質(zhì)的負(fù)載量，響應(yīng)電流得到增強(qiáng)。該適體傳感器響應(yīng)快，特異性好，對(duì)于目標(biāo)物的檢測(cè)范圍較寬，是一種高靈敏度、選擇性好的溶菌酶檢測(cè)方法。

[1]Ellington A D,Szostak J W.In vitro selection of RNA molecules that bind specif i c ligands[J].Nature,1990,346(6287):818～822.

[2]Tuerk C,Gold L.Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNAligands to bacteriophage T4DNApolymerase[J].Science,1990,249(101126):505～510.

[3]Tombelli S,Minunni M.Analytical applications of aptamers[J].Biosens.Bioelectron.,2005,20(12):2 424 ～2 434.

[4]Yang R H,Tang Z W,Yan J L,et al.Noncovalent assembly of carbon nanotubes and single-strande DNA;An effective sensing platform for probing biomolcular interactions[J].Analytical Chemistry,2008,80(19):7 408～7 413.

[5]Dong H,Gao W,Yan F,et al.Fluorescence resonace energy transfer between quantum dots and grapehne oxide for sensing biomolculars[J].Analytical Chemistry,2010,82(13):5 511～5 517.

[6]Song Y J,Qu K G,Zhao C,et al.Grapehne oxide:Intrinsic peroxidase catalytic activity and its application to gucose detection[J].Advanced Materials,2010,22(19):2 206～2 210.

[7]Ai K L,Liu Y L,Lu L H.Hydrogen bonding recognitioninduced color change of gold nanoparticles for visual detection of melamine in raw milk and infant formula[J].J.Am.Chem.Soc.,2009,131(27):9 496～9 497.

[8]Joo J,Kwon D,Yim C,et al.Highly Sensitive Diagnostic Assay for the Detection of Protein Biomarkers Using Microresonators and Multifunctional Nanoparticles[J].ACS Nano,2012,6(5):4 375～4 381.

[9]Liss M,Petersen B,Wolf H,et al.An aptamer-based quartz crystal protein biosensor[J].Anal.Chem.,2002,74(17):4 488～4 495.

[10]Baker B R,Lai R Y,Wood M S,et al.An electronic,aptamer-based small-molecule sensor for the rapid,labelfree detection of cocaine in adulterated samples and biological f l uids[J].J.Am.Chem.Soc.,2006,128(10):3 138～3 139.

[11]Zuo X L,Song S P,Zhang J,et al.Atarget-responsive electrochemical aptamer switch (TREAS)for reagentless detection of nanomolar ATP[J].J.Am.Chem.Soc.,2007,129(5):1 042～1 043.

[12]Jin Y,Yao X,Liu Q,et al.Hairpin DNA probe based electrochemical biosen-sor using methylene blue as hybridization indicator[J].Biosens.Bioelectron.,2007,22(6):1 126～1 130.

[13]Zayats M,Huang Y,Gill R,et al.Label-free reagentless aptamer based sensors for smallmolecules[J].J.Am.Chem.Soc.,2006,128(42):13 666～13 667.

[14]Zhao J,Zhang Y,Li H.Ultrasensitive electrochemical aptasensor for thrombin based on the amplif i cation of aptamer–AuNPs–HRP conjugates[J].Biosensors and Bioelectronics,2011,26(5):2 297～2 303.

[15]Bai J,Wei H,Li B.[Ru(bpy)2(dcbpy)NHS]Labeling/Aptamer-Based Biosensor for the Detection of Lysozyme by Increasing Sensitivity with Gold Nanoparticle Amplification[J].Chem.Asian J.,2008,3:1 935～1 941.

[16]Radi A,Acero J L,nchez S.Reagentless,Reusable,Ultrasensitive Electrochemical Molecular Beacon Aptasensor[J].J.Am.Chem.Soc.,2006,128:117～124.

[17]Bo Y,Yang,H Y,et al.A novel electrochemical DNA biosensor based on graphene and polyaniline nanowires[J].Electrochimica Acta,2011,56(6):2 676～2 681.

[18]Zhang M G,Smith A,Gorski W.Carbon Nanotube-Chitosan System for Electrochemical Sensing Based on DehydrogenaseEnzymes[J].Anal.Chem.,2004,76(17):5 045～5 050.

[19]Bott A W,Heineman W R.Chronocoulometry[J].Current Separations,2004,20:121～126.

[20]Adams R N.Electrochemistry at Solid Electrodes[M].New York:Marcel Dekker,1969.220～221.