霍志云，童 欽，胡嘉欣，王 煒＊

（1.華威特（北京）生物科技有限公司，北京 100085；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130122）

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3）屬于單分子負(fù)鏈 RNA 病毒目（Mononegavirles）副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）呼吸道病毒屬（Respirovirus）的成員[1]，又稱為運(yùn)輸熱病毒，是引起牛羊呼吸系統(tǒng)疾病的病毒之一[2]。牛副流感病毒在世界各國(guó)普遍存在，呈現(xiàn)不同的流行程度，人及其他動(dòng)物體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)BPIV3的抗體。檢測(cè)方法主要有病毒中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、間接免疫熒光及血凝抑制試驗(yàn)等，其中病毒中和試驗(yàn)是經(jīng)典的鑒定BPIV3的血清學(xué)檢測(cè)方法，該方法敏感性強(qiáng)、特異性高，具有很高的應(yīng)用價(jià)值，許多新建立的方法必需以該方法作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。鑒于3型牛副流感給肉牛和奶牛產(chǎn)業(yè)造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)該病應(yīng)引起足夠重視。本試驗(yàn)采用病毒中和試驗(yàn)方法對(duì)中國(guó)北方部分地區(qū)牛場(chǎng)的血清樣品進(jìn)行BPIV3的血清學(xué)調(diào)查，以掌握牛群中的BPIV3的分布情況，為其防治和凈化提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血液樣本的采集 自內(nèi)蒙古、吉林、山西采集血液樣本482份，均未免疫接種BPIV3疫苗。

1.1.2 試劑和器材 BPIV3標(biāo)準(zhǔn)株，陰性血清，陽性血清，MDBK細(xì)胞，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所人獸共患病實(shí)驗(yàn)室保存；聚苯乙烯管，單道自動(dòng)移液器，漩渦振蕩器，CO2培養(yǎng)箱，生物安全柜，離心機(jī)，水浴鍋，滅菌槍頭。

1.2 方法

1.2.1 血清收集 采集10mL血液樣本離心（1500r／min，15min），收集血清，于－20℃保存。

1.2.2 血清滅活 試驗(yàn)時(shí)，將血清至于水浴鍋中，56℃滅活30min。

1.2.3 血清稀釋 用PBS將血清兩倍倍比稀釋，從1∶2稀釋至1∶4096，每份血清樣品做一個(gè)重復(fù)。

1.2.4 中和用病毒的稀釋 用DMEM將已知毒價(jià)的PI3標(biāo)準(zhǔn)毒進(jìn)行稀釋，稀釋完成后取100μL加到稀釋好的100μL的血清中，此時(shí)標(biāo)準(zhǔn)毒的終濃度應(yīng)為50TCID50／100μL～300TCID50／100μL。在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h。

1.2.5 細(xì)胞接種 將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h的細(xì)胞，棄去生長(zhǎng)培養(yǎng)基，每孔加100μL培養(yǎng)基洗板。從培養(yǎng)箱中取出中和1h的培養(yǎng)板，用12道移液器吸取100μL病毒血清中和混合物每列對(duì)應(yīng)加到細(xì)胞培養(yǎng)板中。

1.2.6 回滴 利用最終確定的中和用病毒進(jìn)行回滴試驗(yàn)，取一新的細(xì)胞培養(yǎng)板用稀釋液將中和用病毒1∶1稀釋，與血清病毒中和板一同置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，1h后將上述稀釋好的病毒做10倍倍比稀釋，從10－1稀釋到10－3，將長(zhǎng)滿單層的細(xì)胞培養(yǎng)板棄去培養(yǎng)基，每孔加100μL DMEM洗板，將待回滴的病毒懸液100μL／孔加到細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度8孔。從較低濃度到較高濃度添加，并做好空白對(duì)照，回歸滴度在同一板在上作1個(gè)重復(fù)。3d～5d后觀察結(jié)果。

1.2.7 記錄與計(jì)算 記錄試驗(yàn)結(jié)果，通過Spearman－Karber方法計(jì)算血清效價(jià)和回歸滴度。

1.2.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所得數(shù)據(jù)用SAS進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)果判定條件

陰性細(xì)胞對(duì)照無CPE；陽性對(duì)照血清效價(jià)在2倍于其確定的平均值之內(nèi)；陰性血清對(duì)照效價(jià)＜2，被檢血清效價(jià)≥2判定為陽性。

2.2 BPIV3的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果

采用病毒中和試驗(yàn)的方法對(duì)采自吉林、內(nèi)蒙、山西的482份血清，進(jìn)行BPIV3抗體檢測(cè)，檢出陽性血清439份，陽性率為91.08%，不同地區(qū)BPIV3清學(xué)調(diào)查結(jié)果見表1。

表1 北方三?。▍^(qū)）部分地區(qū)牛血清BPIV3抗體檢測(cè)結(jié)果Table1 A serological survey of antibodies against bovine parainfluenza virus type 3in three regions of north China

吉林、內(nèi)蒙、山西BPIV3流行率、標(biāo)準(zhǔn)誤及95%的可信區(qū)間分別為97.35%、2.25、79.31% ～89.31%，84.31%、1.67、91.88% ～98.42% 及95.15%、1.51、94.40%～100%（表2）。

表2 BPIV3血清陽性率的標(biāo)準(zhǔn)誤和95%置信區(qū)間Table2 Standard error and 95%confidence interval for BPIV3seropositive rate

3 討論

牛呼吸系統(tǒng)疾病使肉牛業(yè)和奶牛業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。病毒感染是引起疾病的主要因素，而BPIV3是引起牛呼吸系統(tǒng)疾病最重要的病毒之一。本病很少引起動(dòng)物的死亡，細(xì)菌激發(fā)感染后，引起伴隨肺炎的二重感染。副黏病毒具有潛在的種間傳播的能力。盡管BPIV3有感染人的潛能，但通常認(rèn)為BPIV3并不是嚴(yán)重的人畜共患病[4]。

歐美國(guó)家對(duì)BPIV3進(jìn)行了大量的流行病學(xué)調(diào)查，Intisar K S等[5]采用 BPIV3ELISA 試劑盒，對(duì)采自不丹各地的495份駱駝的血清進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清陽性率平均值為82.2%，血清陽性率最高可達(dá)92.6%。H?gglund S等[6]對(duì)病毒引起的呼吸道系統(tǒng)疾病進(jìn)行了6年的研究發(fā)現(xiàn)，BPIV3在牛群中每年都會(huì)造成感染，并且具有很高的感染水平，Solís－Calderón JJ等[7]調(diào)查發(fā)現(xiàn)墨西哥肉牛BPIV3血清陽性率為85.6%。芬蘭進(jìn)行的牛血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)80%的血清樣本呈BPIV3陽性[8]。采用間接ELISA試劑盒對(duì)伊朗的馬什哈德地區(qū)奶牛進(jìn)行BPIV3的血清陽性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果90%的血清呈陽性[9]。但我國(guó)尚未對(duì)BPIV3流行病學(xué)進(jìn)行大量的調(diào)查，因此，對(duì)BPIV3流行情況了解甚微。

本研究采用病毒中和的試驗(yàn)方法，對(duì)我國(guó)吉林、內(nèi)蒙和山西的部分牛群進(jìn)行了BPIV3抗體檢測(cè)，血清陽性率分別為97.35%、84.31%、95.15%；與國(guó)外近幾年進(jìn)行的BPIV3血清學(xué)調(diào)查結(jié)果相符和，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)BPIV3在牛群中廣泛存在。造成BPIV3血清陽性率高的原因可能有以下幾個(gè)方面，首先本病毒是一種高度接觸性傳染病，可以通過呼吸道傳播；其次，動(dòng)物飼養(yǎng)密度大，一旦引進(jìn)一頭患病動(dòng)物，病毒將會(huì)在畜群中快速傳播。最后，本病通常引起輕微的臨床癥狀，易被忽視，因此沒有及時(shí)采取防控措施，使疾病得有效的控制。

本研究對(duì)北方三?。▍^(qū)）的牛群進(jìn)行抽樣調(diào)查，計(jì)算各地流行率的平均值、率的標(biāo)準(zhǔn)誤及可信區(qū)間，率的標(biāo)準(zhǔn)誤小，說明抽樣誤差小，表示樣本率對(duì)總體率的代表性好，反之，率的標(biāo)準(zhǔn)誤大，樣本對(duì)總體率的代表性差。

另外，從BPIV3陽性血清中隨機(jī)抽取169份，進(jìn)行了抗體滴度的測(cè)定，山西的BPIV3陽性血清的抗體滴度主要分布在1∶32～1∶64之間，占山西陽性血清樣品數(shù)的91.3%；吉林陽性血清抗體滴度主要集中于1∶16～1∶32，占吉林陽性血清樣品數(shù)的70.1%；內(nèi)蒙陽性血清抗體滴度主要集中于1∶128，占內(nèi)蒙陽性血清樣品數(shù)的67.9%（數(shù)據(jù)未顯示），抗體的存在表明牛群目前或近期接觸過病毒，但并不能代表其具有了抵抗力。從北方三?。▍^(qū)）調(diào)查數(shù)據(jù)可見，BPIV3在我國(guó)吉林、內(nèi)蒙、山西牛群中普遍存在，為更詳細(xì)的了解本病在我國(guó)的流行情況，在全國(guó)范圍內(nèi)進(jìn)行全面的BPIV3流行病學(xué)調(diào)查是十分必要的。另外，應(yīng)增加對(duì)本病的關(guān)注，采取有效的防控措施，降低病毒在牛群中的傳播水平，保護(hù)畜群健康安全。

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