葛成龍 徐 娜 方婷婷 田德英

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院感染科，武漢 430030）

我國重型肝炎發(fā)病率高，搶救治療難度大，預后極差。腸源性內(nèi)毒素血癥參與重型肝炎各種并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，嚴重影響其預后。預防和控制內(nèi)毒素血癥的發(fā)生是成功治療重型肝炎的關鍵。近年來研究發(fā)現(xiàn)，粒細胞集落刺激因子 （granulocyte col－onystimulating factor，G－CSF）除了促進中性粒細胞系造血細胞的增殖、分化和活化外，還具有免疫調(diào)節(jié)的作用［1］。這種免疫調(diào)節(jié)作用可能對各種原因所致的肝損傷具有保護作用［2］。為了尋求重型肝炎新的治療措施，本研究旨在觀察G－CSF對小鼠內(nèi)毒素血癥急性肝損傷的作用，并探討其可能機制。

材料和方法

1.材料

1.1 主要試劑與藥品

重組人粒細胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colonystimulating factor ，rhGCSF）（商品名：吉賽欣），華北制藥金坦生物技術股份有限公司生產(chǎn)；內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）（E.coli 055 ：B5），美國sigma公司產(chǎn)品；小鼠TNF－a ELISA 試劑盒、IL－10ELISA 試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動物

昆明（KM）小鼠，SPF級，均為雄性，18－22g，購自湖北省實驗動物研究中心，動物許可證號：SCXK（鄂）2008－0005。

2.方法

2.1 動物模型制備與分組

KM 小鼠腹腔注射 LPS（E.coli 055 ：B5）10mg/kg（參照文獻［3，4］）制備小鼠內(nèi)毒素性急性肝損傷模型。

實驗小鼠隨機分為3組，每組12只，即①內(nèi)毒素肝損傷模型組（模型組）；②rhG－CSF預防組（預防組）；③正常對照組（正常組）。模型組腹腔注射LPS（E.coli 055：B5）10mg/kg，預防組于造模前1小時皮下注射rhG－CSF500ug/kg（預實驗選定），正常組腹腔注射等劑量的生理鹽水。各組分別在注射LPS后6h、24h兩個時間點隨機抽取6只小鼠，進行觀察檢測。另外41只小鼠，模型組21只，預防組20只，模型組腹腔注射LPS 30mg/kg，預防組在腹腔注射LPS30mg/kg前1小時皮下注射rhGCSF500ug/kg，觀察兩組小鼠的存活率。

2.2 觀察指標

2.2.1 小鼠的存活率

觀察兩組小鼠注射LPS 30mg/kg后72h小鼠的存活率。

2.2.2 血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）的濃度

各組小鼠分別在注射LPS后6h、24h用2%戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈采血，室溫下靜置4－6h后，3000r/min離心10min，吸取上層血清，取100μl血清與生理鹽水1∶1稀釋，全自動生化儀檢測AST、ALT濃度。

2.2.3 肝臟組織的病理變化

肉眼觀察肝臟形態(tài)、色澤、包膜等；取各肝同一部位，置于4%的多聚甲醛溶液中固定后，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察肝組織的病理變化。

2.2.4 血清 TNF－a與IL－10的濃度

按小鼠TNF－a、IL－10ELISA 試劑盒操作說明書進行操作。

3.統(tǒng)計學處理

應用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組存活率比較采用χ2檢驗，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，P值均為雙尾值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.rhG－CSF對小鼠存活率的影響

預防組和模型組小鼠在注射LPS 30mg/kg后12h開始死亡，72h兩組小鼠數(shù)量基本趨于穩(wěn)定，預防組20只小鼠存活16只，存活率80%，模型組21只小鼠存活14只，存活率66.67%，兩組相比差異無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.928，P＝0.335＞0.05）。如表1所示。

表1 rhG－CSF對小鼠存活率的影響Table1 The effect of rhG－CSF on survival rate of the mice

2.rhG－CSF對小鼠肝功能的影響

預防組與模型組相比，6h和24h時間點ALT、AST均明顯降低，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），如圖1所示。

圖1 rhG－CSF對小鼠肝功能的影響Fig 1 The effect of rhG－CSF on liver function of mice

圖3 rhG－CSF對小鼠血清 TNF－a、IL－10的影響Fig 3 The effect of rhG－CSF on the level of serum TNF－a and IL10of mice

3.rhG－CSF對小鼠肝臟病理組織的影響

3.1 肉眼觀察

正常組小鼠肝臟形態(tài)正常，色澤紅潤，包膜光滑，質(zhì)地柔軟。模型組小鼠給予LPS后6h肝臟組織輕微腫脹，24h肝臟組織明顯腫脹，其中大部分小鼠肝臟表面可見點狀及片狀出血點。與模型組6h及24h時間點相比，預防組小鼠肝臟充血水腫程度較輕，點狀出血點較少，無片狀出血點。

3.2 光鏡觀察

正常組小鼠6h及24h時間點肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，未見炎性細胞浸潤。模型組兩個時間點均可見肝細胞輕微腫脹、有散在炎性細胞浸潤，部分肝細胞出現(xiàn)核固縮，部分區(qū)域可見點狀及片狀壞死。預防組僅見到少量炎性細胞浸潤，無點狀及片狀壞死。如圖2所示。

4.rhG－CSF對小鼠血清 TNF－a、IL－10的影響

正常小鼠血清 TNF－a、IL－10表達量極低，造模后這兩種細胞因子水平明顯升高，而予以rhG－CSF預處理后，抑炎因子IL－10在6h點明顯高于模型組（P＜0.05），24h點與模型組相比無明顯差異（P＞0.05）。預防組下調(diào)血清促炎因子TNF－a的效應與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。如圖3所示。

圖2 rhG－CSF對小鼠肝臟病理組織的影響（HE×400）Fig 2 The effect of rhG－CSF on liver histopathology of mice（HE×400）

討 論

重型肝炎是由于各種原因如肝炎病毒、酒精、藥物等引起的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，從而出現(xiàn)以凝血機制障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組癥候群。在我國，引起重型肝炎的主要病因是肝炎病毒（主要是HBV），其次是藥物及肝毒性物質(zhì)（如酒精、化學制劑等）［5］。盡管重型肝炎的發(fā)病機制尚未完全明確，目前一般認為其發(fā)病主要與腸道菌群移位、機體受到內(nèi)毒素二次打擊密切相關。內(nèi)毒素可以作用于肝臟枯否細胞釋放各種細胞因子如促炎因子 TNF－a、INF－γ和抑炎因子IL－10、IL－6，改變促炎因子和抑炎因子的平衡，這種平衡的改變在重型肝炎的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用［1］。

G－CSF是一種造血源性細胞生長因子，主要用于各種原因所致的粒細胞減少癥，同時它還能誘導骨髓干細胞增殖，并動員入血，使自體骨髓移植成為可能。因rhG－CSF與鼠源性G－CSF有相似蛋白質(zhì)系列和生物學效應，而被廣泛應用于動物實驗。近年來有研究表明，rhG－CSF能改善動物各種肝毒性化學物質(zhì)導致的肝臟損傷，促進肝細胞再生，提高動物的存活率［2，6，7］。然而，也有少部分研究表明rhGCSF不但不能改善動物肝損傷的血清學指標、組織損傷及存活率，甚至抑制肝細胞再生［8，9］。

rhG－CSF保護小鼠急性肝損傷的機制目前尚不明確，大部分研究認為G－CSF主要通過刺激骨髓造血干細胞定植于損傷肝組織，與受損肝細胞微環(huán)境相互作用從而增加內(nèi)源性肝細胞修復進程［2，6，10］。也有學者認為，rhG－CSF保護化學性肝損傷小鼠的作用可能是激發(fā)了某種內(nèi)源性修復機制［7］，通過抑制細胞凋亡而發(fā)揮保護作用。Shaklee等［1］研究認為G－CSF能減少LPS誘導的促炎性因子TNF－a和INF－γ的釋放，增加抑炎因子IL－6和IL－10的產(chǎn)生，從而導致機體抑炎和促炎平衡發(fā)生改變，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

本研究通過給內(nèi)毒素性急性肝損傷小鼠預防性皮下注射rhG－CSF，觀察造模后6h和24h兩個時間點結(jié)果，均表明rhG－CSF對內(nèi)毒素性急性肝損傷小鼠具有保護作用，能明顯減低小鼠肝組織病理損傷，降低血清ALT、AST含量，減少肝臟炎癥反應，但rhG－CSF并不能提高內(nèi)毒素性急性肝損傷小鼠的存活率。另外，本研究也初步探討了預防組與模型組小鼠血清TNF－a和IL－10的含量變化，發(fā)現(xiàn)rhG－CSF保護小鼠內(nèi)毒素性急性肝損傷機制之一可能是增加抑炎性因子IL－10的水平，但其具體機制尚需進一步研究證實。

［1］Shaklee CL，Guo J，F(xiàn)aggioni R，et al.Pretreatment with granulocyte－colony stimulating factor decreases lipopolysaccharide－induced interferon－gamma production in mice in association with the production of interleukin－18.Cytokine，2004，25（3）：119－126

［2］Zhang L，Kang W，Lei Y，et al.Granulocyte colonystimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D－galactosamine－induced acute liver failure.Toxicol Lett，2011，204（1）：92－99

［3］Zhen YH，F(xiàn)ang R，Ding C，et al.Efficacy of specific IgY for treatment of lipopolysaccharide－induced endotoxemia using a mouse model.J Appl Microbiol，2011，111（6）：1524－1532

［4］王琳琳，周婭，梁錦屏等.槐定堿預防小鼠內(nèi)毒素性肝損傷的作用及對肝臟CD14、TLR4表達的影響.寧夏醫(yī)科大學學報，2009，31（6）：709－712，722，封3

［5］中華醫(yī)學會感染病學分會肝衰竭與人工肝學組，中華醫(yī)學會肝病學分會重型肝病與人工肝學組.肝衰竭診療指南.中華肝臟病雜志，2006，14（9）：643－646

［6］Li N，Zhang L，Li H，et al.Administration of granulocyte colony－stimulating factor ameliorates radiation－induced hepatic fibrosis in mice.Transplant Proc，2010，42（9）：3833－3839

［7］Yannaki E，Athanasiou E，Xagorari A，et al.G－CSF－primed hematopoietic stem cells or G－CSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury，predominantly by promoting endogenous repair programs.Exp Hematol，2005，33（1）：108－119

［8］Caraceni P，Giannone F，Catani L，et al.Effects of granulocyte colony stimulating－factor in a rat model of acute liver injury.Dig Liver Dis，2007，39（10）：943－951

［9］Ogiso T，Nagaki M，Takai S，et al.Granulocyte colony－stimulating factor impairs liver regeneration in mice through the up－regulation of interleukin－1beta.J Hepatol，2007，47（6）：816－825

［10］Piscaglia AC，Shupe TD，Oh SH，et al.Granulocytecolony stimulating factor promotes liver repair and induces oval cell migration and proliferation in rats.Gastroenterology，2007，133（2）：619－631