王 豐 屠冠軍 朱 悅

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 110001）

Nogo－66是脊髓損傷后抑制神經(jīng)再生的重要因子。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)Nogo－66的受體（Nogo－66receptor，NgR），神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中神經(jīng)元的神經(jīng)突生長會受到Nogo－66活性片段Nogo－p4的抑制［1］。在后續(xù)研究中，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞在其分化形成星形膠質(zhì)細(xì)胞的過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的亞型之一雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起生長也可以被Nogo－p4所抑制，并且該抑制作用由NgR所介導(dǎo)，現(xiàn)報道如下。

材料和方法

1.實驗動物

出生后24h內(nèi)的Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。

2.主要試劑

表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、NgR和nestin兔抗鼠單克隆抗體購自Chemicon公司；堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basal fibroblast growth factor，bFGF）、DMEM/F12培養(yǎng)基、B27、Alexa Fluor?488羊抗兔熒光二抗、PI和Zenon Tricolor熒光標(biāo)記 試 劑 盒、Block－It Fluorescent Oligo 、LIPOFECTAMINE 2000REAGENT和OPTI MEM I均購自Invitrogen公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）兔抗鼠單克隆抗體、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）兔抗鼠單克隆抗體和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）兔抗鼠單克隆抗體購自武漢博士德公司。Nogo－p4購自ADI公司。Western blot蛋白檢測試劑盒購自KPL公司。

3.神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取4只出生24h內(nèi)的Wistar大鼠，處死后在超凈臺內(nèi)取出大鼠脊柱，以眼科剪刀剪開椎板，取出脊髓置入裝有4℃D－Hanks液平皿中。將脊髓剪碎，清洗后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化40min，離心棄去胰酶，加入添加有B27、20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF的 DMEM－F12培養(yǎng)基，重懸浮，200目細(xì)胞篩過濾后接種于培養(yǎng)瓶中（1×108/L），置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3－4d更換培養(yǎng)液。

4.神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定

4.1 Nestin免疫熒光染色

培養(yǎng)1w后，取神經(jīng)球以冷丙酮固定10min，滴在載玻片上烘干，0.01mol/L PBS漂洗3次，5%BSA封閉15min，棄去血清滴加nestin兔抗鼠單克隆抗體，以PBS代替一抗作為對照，4℃過夜。0.01mol/L PBS漂洗3次，滴加5μg/mlAlexa Fluor?488羊抗兔熒光二抗，避光室溫孵育1h。PBS漂洗3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。

4.2 誘導(dǎo)分化

取神經(jīng)球盡量吹打分散成單細(xì)胞，將神經(jīng)干細(xì)胞懸液（1×108/L）加入預(yù)先已置入玻璃蓋片（直徑14mm）的6孔培養(yǎng)板中，加入10%胎牛血清。7d后取出蓋片，分別以NSE，GFAP和MBP抗體標(biāo)記，PI標(biāo)記細(xì)胞核，常規(guī)方法免疫熒光染色。

5.小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）的設(shè)計和合成

利用Invitrogen公司網(wǎng)上siRNA設(shè)計軟件設(shè)計3條大鼠NgR mRNA的siRNA，由Invitrogen公司進(jìn)行合成相應(yīng)的雙鏈RNA（double stranded RNA，dsRNA）。經(jīng)預(yù)試驗篩選出阻斷NgR基因最有效的一條dsRNA，其序列為：

Sequence（5＇to 3＇）：－UGC AGU ACC UCU ACC UAC AAG ACA ASequence（5＇to 3＇）：－UUG UCU UGU AGG UAG AGG UAC UGC A隨機(jī)打亂順序的siRNA（scrambled siRNA）作為陰性對照也由Invitrogen公司進(jìn)行合成。

6.實驗分組

將神經(jīng)干細(xì)胞分為A，B，C，D四組。將神經(jīng)球盡量吹打分散成單細(xì)胞，將神經(jīng)干細(xì)胞懸液加入已放入蓋片的六孔培養(yǎng)皿中，A組加入10%胎牛血清使神經(jīng)干細(xì)胞開始分化；B組加入10%胎牛血清和4μmol/L的 Nogo－p4［1］；C組的神經(jīng)干細(xì)胞懸液經(jīng)過NgR基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染24h后，加入10%胎牛血清；D組的神經(jīng)干細(xì)胞懸液經(jīng)過NgR基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染24h后，加入10%胎牛血清和4μmol/L的 Nogo－p4。

7.siRNA的轉(zhuǎn)染

取1ml含神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)液加入離心管，800r/min離心5min，棄上清，加入900μl不含抗生素的培養(yǎng)基，機(jī)械吹打分散細(xì)胞。

a.將50pmol NgR基因特異性siRNA用50 μl of Opti－MEM 稀釋，混勻。

b.將1μl Lipofectamine.2000加入50μl Opti－MEM，混勻，室溫孵育15min。

c.混合a液和b液，輕柔混合，室溫孵育15min。

將混合物加入神經(jīng)干細(xì)胞懸液中，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，于24h后檢測NgR基因表達(dá)。另取部分神經(jīng)干細(xì)胞以熒光標(biāo)記的siRNA（Block－It Fluorescent Oligo）進(jìn)行相同條件下的轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡下觀察并計算轉(zhuǎn)染效率。

8.NgR基因表達(dá)的檢測

8.1 免疫熒光染色

轉(zhuǎn)染24h后的神經(jīng)干細(xì)胞懸液800r/min離心5min，丙酮固定，滴在蓋片上晾干，牛血清封閉非特異性背景15min，加入NgR兔抗鼠單克隆抗體過夜，PBS洗3次，滴加5μg/mlAlexa Fluor?488羊抗兔熒光二抗，避光室溫孵育2h。PBS漂洗3次，PI染色細(xì)胞核5min，PBS漂洗3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。每張蓋片隨機(jī)取10個視野，計數(shù)NgR陽性細(xì)胞數(shù)N和總細(xì)胞數(shù)T，計算阻斷效率（T－N）/T。實驗重復(fù)3次。

8.2 Western blot

細(xì)胞懸液經(jīng)離心收集細(xì)胞，棄去上清，加400μl裂解液，冰上裂解30min。將裂解液4℃、12000rpm離心5min，取上清分裝于0.5ml離心管中。用Bradford法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。蛋白上樣量30μg，上樣前將樣品于沸水中煮5min。電泳后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜。5%的脫脂牛奶封閉非特異性背景，室溫1h。將兔抗鼠NgR抗體用TBST稀釋至1∶400，將膜放入一抗稀釋液中，4℃過夜。用TBST在室溫下洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育2h。用KPL公司的蛋白檢測試劑盒顯色。

9.雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起長度的測量

分化第7d，每組取3片蓋片，進(jìn)行GFAP熒光標(biāo)記，PI標(biāo)記細(xì)胞核。熒光顯微鏡下觀察照相，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，將其分類。使用Image－Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞突起長度的測量［2］。每次實驗在200倍熒光顯微鏡下隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行測量，實驗重復(fù)3次，取平均值。

10.統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以SPSS11.5軟件進(jìn)行處理，差異顯著性采用單因素方差分析。

結(jié) 果

懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞形成典型的神經(jīng)球，經(jīng)免疫熒光檢測nestin表達(dá)陽性。加入10%胎牛血清分化1周后，可觀察到NSE，GFAP和MBP標(biāo)記陽性的細(xì)胞。這表明培養(yǎng)出的神經(jīng)球具備分化成神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的能力，是神經(jīng)干細(xì)胞。參見本研究前期報道［1］。神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)NgR基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染后大部分細(xì)胞存活，少量細(xì)胞死亡，存活的細(xì)胞活力良好，超過24h后不再出現(xiàn)細(xì)胞死亡。Western blot檢測的結(jié)果證實經(jīng)NgR基因特異性siRNA轉(zhuǎn)染后24h的神經(jīng)干細(xì)胞NgR表達(dá)顯著降低。參見本研究前期報道［3］。

GFAP是公認(rèn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物。分化第7d，各組均可觀察到形態(tài)顯著不同的GFAP＋細(xì)胞。胞體延長形星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞體延長，細(xì)胞突起明顯，分支較少或沒有分支（圖1A）。星狀星形膠質(zhì)細(xì)胞具有較小的細(xì)胞體，星狀的突起分支多而明顯（圖1B）。雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞為雙極細(xì)胞，兩側(cè)各有一細(xì)長突起，沒有分支，A－D組分別對應(yīng)圖1C，D，E，F(xiàn)。雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞在各組中占GFAP＋細(xì)胞的比率見表1，組間沒有顯著差異。各組中雙極形細(xì)胞形態(tài)基本一致。B組（圖1D）中雙極形細(xì)胞的突起長度明顯短于其它各組（圖1C，E，F(xiàn)），P＜0.01。A，C和D組間雙極形細(xì)胞的突起長度沒有顯著差異。經(jīng)顯微測量，各組中雙極形細(xì)胞突起的平均長度見表1。

表1 雙極形細(xì)胞占GFAP＋細(xì)胞的比率和突起平均長度（n＝4）Table1 The ratio of bipolar astrocyte in GFAP＋cells and the average process length of bipolar cells

討 論

神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）可分化產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，這使得NSC移植治療脊髓損傷成為可能。以往研究者多致力于提高神經(jīng)干細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的比率，認(rèn)為神經(jīng)元在神經(jīng)功能恢復(fù)過程中起主導(dǎo)作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞因其在脊髓損傷后形成膠質(zhì)瘢痕，曾被認(rèn)為是軸突再生的障礙［4］。近年來有體外實驗證實星形膠質(zhì)細(xì)胞具有合成和分泌營養(yǎng)因子的功能，可以促進(jìn)神經(jīng)元的軸突生長［5］。現(xiàn)在認(rèn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞對再生軸突具有阻礙軸突穿越和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)軸突再生的雙重作用［6］。隨著人們對其多樣性和功能的復(fù)雜性逐漸認(rèn)識，星形膠質(zhì)細(xì)胞的分類和功能重新成為研究的熱點和難點，神經(jīng)干細(xì)胞定向分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞的工作也逐漸開展。神經(jīng)干細(xì)胞分化形成的星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅可以補(bǔ)充和替代中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷區(qū)的細(xì)胞，還可以維持神經(jīng)元的存活和促進(jìn)軸突的生長，甚至可以做為藥物載體長期發(fā)揮治療作用［7，8］。

微環(huán)境決定了干細(xì)胞分化結(jié)局和分化細(xì)胞亞型特點，細(xì)胞外基質(zhì)中的成分對神經(jīng)干細(xì)胞分化形成星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響是微環(huán)境調(diào)控的研究熱點［9］。Nogo－66是脊髓損傷后微環(huán)境中重要的神經(jīng)再生抑制因子，Grandpre T等發(fā)現(xiàn)Nogo－66的活性片段Nogo－p4在濃度為4μmol/L時可以抑制雞胚背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞神經(jīng)突生長［10］。本研究前期工作發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞表面表達(dá) Nogo－66受體（NgR），Nogop4通過NgR可以抑制神經(jīng)干細(xì)胞分化形成神經(jīng)元的神經(jīng)突生長［1］。在后續(xù)研究中，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞可以分化成不同形態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，Nogop4對神經(jīng)干細(xì)胞分化形成的雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起生長也有抑制作用。為證實該抑制作用是否由NgR所介導(dǎo)，進(jìn)行了本次實驗研究。

本研究證實大鼠脊髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞在體外能夠分化成不同形態(tài)類型的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型。Robert H Miller最早報道了體外培養(yǎng)大鼠脊髓的不同形態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞［11］。本研究中神經(jīng)干細(xì)胞分化成的星形膠質(zhì)細(xì)胞分別對應(yīng)于Robert H Miller研究中的胞體延長形，星形和雙極形。國外學(xué)者針對膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性，不同形態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞的不同功能進(jìn)行了探索性的研究。目前還不清楚不同形態(tài)的星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后發(fā)揮何種作用［12］。

本研究表明，神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中加入Nogo－p4可以明顯抑制雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起生長。雙極型星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能目前仍不清楚，有學(xué)者認(rèn)為它與神經(jīng)細(xì)胞遠(yuǎn)距離通訊有關(guān)。其突起長度的變化對功能的影響有待進(jìn)一步研究。已有研究指出，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的改變可能具有重要的功能意義［13］。經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)致NgR基因沉默的神經(jīng)干細(xì)胞可以正常分化成雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞，且其占總體星形膠質(zhì)細(xì)胞的比率保持不變，突起長度與對照組相比沒有顯著差異。在NgR基因沉默的神經(jīng)干細(xì)胞中加入Nogo－p4并分化后，雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起長度沒有明顯縮短。因此，Nogo－p4對雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起生長抑制作用可以被NgR基因沉默所阻斷，間接證實了該抑制作用是通過NgR所介導(dǎo)的。

本研究報道了Nogo－p4對神經(jīng)干細(xì)胞分化成雙極形星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起長度影響情況，結(jié)合以往的研究成果，Nogo－66不但對神經(jīng)干細(xì)胞分化成神經(jīng)元有影響，也對星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化產(chǎn)生影響，而且這些影響都是通過NgR所介導(dǎo)，這對于星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性研究和神經(jīng)干細(xì)胞定向分化研究有一定參考價值。我們將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索雙極型星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起的功能意義，觀察神經(jīng)干細(xì)胞移植到動物體內(nèi)后分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞亞型的情況，這對于理解神經(jīng)干細(xì)胞移植后的分化過程，改善神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的效果具有重要意義。

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