陳 虹 張 聲 陳余朋

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，福州 350005）

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和復(fù)發(fā)率非常高，而血管生成是膀胱癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)。如能有效抑制血管新生，切斷腫瘤血供，有望達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的目的。多年研究表明VEGF信號(hào)通路是血管形成發(fā)育早期階段必需的中心環(huán)節(jié)。該發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了VEGF抑制劑的臨床應(yīng)用，但更多的臨床靶基因試驗(yàn)顯示存在VEGF抑制劑耐藥的病例，因此促使人們尋找腫瘤血管生成通路中的其它基因。Delta－Notch是一個(gè)決定細(xì)胞命運(yùn)的信號(hào)系統(tǒng)，尤其是DLL4和Notch4作為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性配體和受體，在血管的新生、發(fā)育和成熟過程中起重要作用。因此DLL4/Notch4成為目前抗腫瘤血管治療最受關(guān)注的新靶點(diǎn)。但DLL4/Notch4和膀胱尿路上皮癌的相關(guān)性研究甚少。本研究采用組織芯片免疫組織化學(xué)方法觀察DLL4和Notch4在膀胱尿路上皮癌和癌旁組織的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，借以探討DLL4和Notch4與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

材料和方法

1.一般資料

依據(jù)隨機(jī)原則，搜集2008年1月至2010年12月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院存檔的石蠟包埋膀胱癌組織85例，男性75例，女性10例，年齡31－83歲，中位年齡65歲，所有病例均有完整的臨床病理資料及隨訪資料。另27例癌旁組織距瘤緣3－5cm。所有病例均由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師按照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，臨床分期按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM分期進(jìn)行［1］。標(biāo)本經(jīng) HE染色，光鏡觀察診斷：浸潤(rùn)性尿路上皮癌40例，其中高級(jí)別23例，低級(jí)別17例；非浸潤(rùn)性乳頭狀尿路上皮癌45例，其中高級(jí)別4例，低級(jí)別41例。臨床分期：Ta 45例，T123例，T29例，T35例，T43例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤62例，化療后復(fù)發(fā)腫瘤23例。

2.組織芯片制備

根據(jù)H.E染色切片在供體組織蠟塊上選取目標(biāo)區(qū)域并標(biāo)記（尿路上皮癌85例，癌旁組織27例），每例膀胱組織取3個(gè)位點(diǎn)，將相應(yīng)組織由供體蠟塊轉(zhuǎn)移至受體蠟塊的陣列孔中，每個(gè)孔芯的直徑約2 mm，每個(gè)蠟塊含有49個(gè)點(diǎn)，最后一個(gè)為標(biāo)志點(diǎn)。

3.主要試劑及方法

兔抗人 Notch4多克隆抗體（sc－5594，1：100稀釋，Santa Cruz公司）；兔抗人DLL4多克隆抗體（HPA023392，1：50稀釋，Sigma公司）。免疫組化操作步驟如下：將組織芯片蠟塊4μm連續(xù)切片，60℃烤片14h，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后水化。高壓熱修復(fù)（檸檬酸pH 6.0，2min），自然冷卻；3%過氧化物酶阻斷10min，強(qiáng)力阻斷劑室溫孵育10 min，不沖洗；一抗室溫孵育2h；Super Enhancer室溫孵育20min；Polymer－HPR孵育30min；DAB顯色鏡下控制；每個(gè)步驟之間PBS沖洗3次，每次3 min。蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

4.免疫組化結(jié)果判讀

Notch4和DLL4陽性表達(dá)為細(xì)胞漿的棕黃色顆粒：Notch4位于膀胱尿路上皮細(xì)胞漿，而DLL4主要位于血管內(nèi)皮細(xì)胞漿。每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，評(píng)價(jià)其陽性細(xì)胞率和著色強(qiáng)度，將切片中細(xì)胞漿著色強(qiáng)度評(píng)分（無，0分；弱，1分；中，2分；強(qiáng)，3分）和切片中陽性細(xì)胞率評(píng)分（＜5%，0分；6%－10%，1分；11%－20%，2分；21%－50%，3分；＞50%，4分）之和為該病例評(píng)分值，將評(píng)分值≤2分定為陰性病例，≥3分定為陽性病例。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法分析Notch4和DLL4表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.組織芯片的HE染色

HE染色顯示組織芯片樣本排列整齊，組織結(jié)構(gòu)完整；尿路上皮癌細(xì)胞層次增多，排列極性紊亂，細(xì)胞核大、深染，可見核分裂象，部分可見異型性明顯的瘤巨細(xì)胞（圖1）；癌旁膀胱黏膜細(xì)胞排列整齊，層次清晰，傘細(xì)胞層存在（圖2）。

2.免疫組化Notch4和DLL4的表達(dá)

Notch4在尿路上皮癌胞漿中呈棕褐色顆粒強(qiáng)陽性表達(dá)（圖3），癌旁組織的膀胱黏膜上皮呈棕黃色顆粒，表達(dá)較弱；尿路上皮癌中Notch4陽性表達(dá)率為89.4%，在癌旁正常膀胱黏膜陽性表達(dá)率為66.7%。兩者差異有顯著性（P＜0.05），具體見表1。

表1 尿路上皮癌和癌旁黏膜Notch4表達(dá)Table1 Notch4in bladder urothelial cancer and cancer side tissue

DLL4主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿表達(dá)呈棕黃色顆粒，少量表達(dá)于尿路上皮癌的胞漿和胞膜（圖4）。尿路上皮癌中DLL4陽性表達(dá)率為54.1% ，癌旁正常膀胱黏膜陽性表達(dá)率為29.6% 。尿路上皮癌中DLL4陽性表達(dá)率高于癌旁正常膀胱黏膜，兩者差異有顯著性（P＜0.05），具體見表2。

Notch4和DLL4在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（表3），顯示：Notch4和DLL4在T2－4期膀胱尿路上皮癌中表達(dá)高于Ta－1期腫瘤，高級(jí)別的膀胱尿路上皮癌表達(dá)高于低級(jí)別腫瘤，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Notch4和DLL4在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)與患者性別、年齡、臨床分期、病理分級(jí)及初復(fù)發(fā)均無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

表2 尿路上皮癌和癌旁黏膜DLL4表達(dá)Table2 DLL4in bladder urothelial cancer and cancer side tissue

表3 Notch4和DLL4表達(dá)與膀胱尿路上皮癌臨床病理特征的關(guān)系Table3 The expression of Notch4and DLL4with the correlation of clinical and pathological feature in bladder urothelial cancer

討 論

Notch信號(hào)途徑是保守進(jìn)化的由多種分子參與的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)通路，是相鄰細(xì)胞之間通訊進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞發(fā)育的典型例子。DLL4是Notch信號(hào)途徑中的一個(gè)重要配體，與其鄰近細(xì)胞的相應(yīng)受體（Notch1和Notch4）結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞，調(diào)節(jié)血管的生成和分支過程。DLL4－Notch信號(hào)系統(tǒng)同樣能干預(yù)腫瘤性血管的生成和發(fā)育。多個(gè)研究小組采用不同方法阻斷DLL4－Notch信號(hào)途徑，均有效抑制了腫瘤組織的生長(zhǎng)。Patel［2］等應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)DLL4，導(dǎo)致 HEY1和EphrinB表達(dá)下調(diào)，繼而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管網(wǎng)形成等這些腫瘤性血管生成的重要過程。Hainaud［3］等利用增加DLL4胞外可溶性片段競(jìng)爭(zhēng)的方法來抑制DLL4的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤中異常的血管重建顯著減少。此外，Noguera－Troise［4］等在荷瘤小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)：增加DLL4－Notch的活性導(dǎo)致腫瘤血管密度降低，原因是腫瘤血管出芽和血管網(wǎng)分支減少；相反，阻斷DLL4－Notch腫瘤血管密度顯著增加，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)血管出芽并含有大量吻合支，但功能學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)新生的血管血流灌注差并且缺氧嚴(yán)重，且與對(duì)照組相比，腫瘤的體積縮小，繼續(xù)阻斷DLL4－Notch，腫瘤變得更小，缺氧更嚴(yán)重，無功能性血管更明顯。Scehnet［5］等同樣也發(fā)現(xiàn)抑制DLL4可誘導(dǎo)未成熟血管增殖，從而使組織血流灌注更差，移植瘤生長(zhǎng)受抑。另外，DLL4－Notch信號(hào)途徑在抑制腫瘤的生長(zhǎng)方面具有血管專一性。Ridgway［6］等使用DLL4特異性抗體處理，實(shí)現(xiàn)了腫瘤生長(zhǎng)的有效抑制，并且這種抑制只發(fā)生在血管新生階段，而對(duì)維持正常血管作用不大；更為可喜的是，這種抑制選擇性影響脈管系統(tǒng)，卻不影響小腸的杯狀細(xì)胞，這個(gè)發(fā)現(xiàn)為腫瘤治療提供更加有利的選擇。DLL4－Notch信號(hào)途徑一方面通過抑制新生血管的過度增殖來減少其形成的數(shù)量，另一方面則通過促進(jìn)新生血管的發(fā)育和成熟來改善腫瘤新生血管的功能，但其中的具體作用機(jī)制尚未完全清楚［7－9］。

已知DLL4和Notch4在多種人類腫瘤血管組織中過度表達(dá)，如乳腺癌、結(jié)直腸癌、骨肉瘤、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等［10－13］。DLL4－Notch信號(hào)通路作為新的抗血管生成的治療靶點(diǎn)，在抑制乳腺癌、纖維肉瘤等實(shí)體瘤生長(zhǎng)已取得顯著效果，而在膀胱尿路上皮癌中的研究才剛剛開始。Patel等發(fā)現(xiàn)膀胱非浸潤(rùn)性尿路上皮癌組織中DLL4的表達(dá)量是正常膀胱組織的2倍，浸潤(rùn)性尿路上皮癌DLL4表達(dá)量是正常組織的1.5倍，且DLL4的表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后相關(guān)［14］。本研究結(jié)果顯示：DLL4和Notch4兩者在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜，說明DLL4和Notch4可能與膀胱尿路上皮癌的發(fā)生相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)臨床分期和病理分級(jí)高的膀胱尿路上皮癌中Notch4和DLL4的表達(dá)均較高，但差異無顯著性，因此，DLL4和Notch4與膀胱尿路上皮癌的進(jìn)展是否相關(guān)，需要擴(kuò)大樣本量來進(jìn)行更深入的研究。

總之，DLL4是由VEGF誘導(dǎo)，并且能負(fù)反饋調(diào)節(jié)血管的出芽和分支，甚至對(duì)抗－VEGF治療抑制的腫瘤，阻斷DLL4也能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，相信隨著DLL4－Notch與膀胱尿路上皮癌關(guān)系的研究不斷深入，聯(lián)合應(yīng)用VEGF和DLL4抑制劑應(yīng)該會(huì)成為膀胱尿路上皮癌抗血管治療新的途徑。

［1］Eble JN，Sauter G，Epstein JI，et al.World Health Organization classification of tumours：pathology and genetics of tumours of the urinary system and male genital organs.Lyon：IARC Press；2004

［2］Patel NS，Li JL，Generali D，et al.Up－regulation of delta－like 4ligand in human tumor vasculature and the role of basal expression in endothelial cell function.Cancer Res，2005，65（19）：8690－8697

［3］Hainaud P，Contrerès JO，Villemain A，et al.The role of the vascular endothelial growth factor－Delta－like 4ligand/Notch4－ephrin B2cascade in tumor vessel remodeling and endothelial cell functions.Cancer Res，2006，66（17）：8501－8510

［4］Noguera－Troise I，Daly C，Papadopoulos NJ，et al.Blockade of Dll4inhibits tumour growth by promoting non－productive angiogenesis.Nature，2006，444（7122）：1032－1037

［5］Scehnet JS，Jiang W，Kumar SR，et al.Inhibition of Dll4－mediated signaling induces proliferation of immature vessels and results in poor tissue perfusion.Blood，2007，109（11）：4753－4760

［6］Ridgway J，Zhang G，Wu Y，et.al.Inhibition of Dll4 signalling inhibits tumour growth by deregulating angiogenesis.Nature，2006，444（7122）：1083－1087

［7］Hellstr?m M，Phng LK，Hofmann JJ，et a1.Dll4signalling through Notch1regulares formation of tip cells during angiogenesis.Nature，2007，445（7129）：776－780

［8］Lobov IB，Renard RA，Papadopoulos N，et al.Deltalike ligand 4（Dll4）is induced by VEGF as a negative regulator of angiogenic sprouting.Proc Natl Acad Sci，2007，104（9）：3219－3224

［9］Suchting S，F(xiàn)reitas C，le Noble F，et a1.The Notch ligand Delta－like 4negatively regulates endothelial tip cell fonnation and vessel branching.Proc Natl Acad Sci，2007，104（9）：3225－3230

［10］Harrison H，F(xiàn)arnie G，Howell SJ，et al.Regulation of breast cancer stem cell activity by signaling through the Notch4receptor.Cancer Res，2010，70（2）：709－718

［11］Li JL，Sainson RC，Shi W，et al.Delta－like 4Notch ligand regulates tumor angiogenesis，improves tumor vascular function，and promotes tumor growth in vivo.Cancer Res，2007，67（23）：11244－11253

［12］Jubb AM，Turley H，Moeller HC，et al.Expression of delta－like ligand 4（Dll4）and markers of hypoxia in colon cancer.Br J Cancer，2009，101（10）：1749－1757

［13］Engin F，Bertin T，Ma O，et al.Notch signaling contributes to the pathogenesis of human osteosarcomas.Hum Mol Genet，2009，18（8）：1464－1470

［14］Patel NS，Dobbie MS，Rochester M，et al.Up－regulation of endothelial delta－like 4expression correlates with vessel maturation in bladder cancer.Clin Cancer Res，2006，12（16）：4836－4844