唐 曦 唐成林 劉仁建

（重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，重慶 400016）

一氧化氮（NO）在神經(jīng)元的發(fā)育，學習和記憶以及與年齡相關的記憶變化中發(fā)揮關鍵的作用［1］。絕經(jīng)后婦女應用雌激素替代療法可以增加血漿硝酸鹽/亞硝酸鹽的含量，這也是NO水平的間接指標［2］，雌激素還可增加腦組織神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）活性和nNOS mRNA 的表達［3］。但 NO本身的直接精確測量是復雜的，因為其不穩(wěn)定的性質和極短的衰變時間［4］。在神經(jīng)細胞中，NO主要由神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）產(chǎn)生［5］，故常用nNOS的檢測間接反映NO合成情況。然而，傳統(tǒng)的雌激素治療由于增加患乳腺癌和子宮癌的風險仍然存在重大的缺陷，因此找到新的治療策略是有必要的［6］。在臨床上，電針對治療老年婦女認知功能障礙有一定的療效，但其作用機制尚不清楚。本實驗采用卵巢切除大鼠模型，造成低雌激素記憶障礙，觀察電針對去卵巢大鼠血清雌激素水平及海馬神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）基因表達的影響，探討電針改善絕經(jīng)后婦女認知功能的機制，以期為臨床相關疾病的治療提供科學依據(jù)。

材料和方法

1.實驗動物分組、模型制備

健康雌性SD大鼠40只，3月齡，體重160－200g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，合格證號：SCXK（瀘）2007－0005。采用隨機數(shù)字法將大鼠隨機分成4組，每組10只：（1）假手術組；（2）模型組；（3）電針組；（4）假電針組。10%水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）按0.3ml/100g，腹腔注射麻醉。假手術組切除卵巢周圍脂肪，其余各組均實行雙側卵巢切除術。（1）（2）組術后不予任何處理；（3）組切除卵巢2周后予電針刺激，選穴方法按華興邦氏的方法實施，選取“足三里”“腎俞”兩穴，在不麻醉的狀態(tài)下采用一次性細美容針刺入穴位，雙側足三里穴接通韓氏電針儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），刺激參數(shù)：連續(xù)脈沖波，頻率3－4Hz，強度4－5mA，以使大鼠后肢抖動為宜，在上午9時開始，每次20min，隔日1次，連續(xù)治療3個月；（4）組針刺操作同（3）組，但不接通電針儀。水迷宮測試結束后，將大鼠麻醉，頸總動脈取血，分離血清。然后在冰面上斷頭取腦，并迅速分離海馬組織，立即將海馬組織置液氮中，于－80℃低溫冰箱保存，用于組織RNA的提取。

2.Morris水迷宮測試

于造模前后、治療后進行測試。

2.1 定位航行試驗：歷時4d，每天上下午各2次，將大鼠面向池壁，分別從4個入水點放入池中，記錄大鼠尋找到并爬上平臺所需時間即為逃避潛伏期時間。

2.2 空間探索試驗：定位航行試驗后去除平臺，將大鼠任選一個入水點將大鼠放入池中，測定其在120s內跨越平臺位置的次數(shù)。

3.酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）

從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，空白孔加標本或標準品稀釋液，其余相應孔中加標本或不同濃度標準品（100μl/孔），用封板膠紙封住反應孔，36℃溫箱孵育90min。提前20min準備生物素化抗體工作液（Estradiol Monoclonal Antibody（4S24（BGN/06/8824）），1.0mg/ml，Thermo Scientific Pierce，USA），洗板5次。空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液（100μl/孔）。用新封板膠紙封住反應孔，36℃溫箱孵育60min。提前20min準備酶結合物工作液?？瞻卓准用附Y合物稀釋液，其余孔加入酶結合物工作液（100μl/孔）。用新封板膠紙封住反應孔，36℃溫箱，避光孵育30min。加入顯色底物100μl/孔，36℃溫箱，避光孵育15min。加入終止液100μl/孔，混勻后即刻測量450nm OD值（3min內）。

4.實時熒光定量PCR檢測

取100mg海馬組織，用Trizol法提取海馬組織總RNA，紫外分析及電泳檢測總RNA的純度、濃度及完整性。所提取RNA經(jīng)分光光度計檢測，其A260/280比值均在1.7－1.9，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S，18S條帶清晰可見，無降解（見圖1）。逆轉錄按ReverTra Ace－α－逆轉錄試劑盒操作步驟進行，反應條件：42℃30min進行反轉錄反應，80℃5min進行反轉錄酶的失活反應，反轉錄產(chǎn)物－20℃保存?zhèn)溆?。引物設計：目的基因及actin的基因序列通過基因庫獲得，用Primer5設計引物，由Invitrogen Biotechnology Co，LTD中國公司合成。

引物名稱 引物序列（5＇－3＇） 片段長度（bp） 退火溫度（℃）R－actin－S CGTTGACATCCGTAAAGACCTC 110 58 R－actin－A TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT R－nNOS－S GAGAGGATTCTGAAGATGAGGG 155 58 R－nNOS－A TTGCTAATGAGGGAGTTGTTC

實時定量RT－PCR反應按THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix試劑盒操作步驟進行，PCR擴增反應條件：預變性95℃，1min；PCR反應；循環(huán)（40次）95℃，15s→58℃，20s→72℃，20s；末段延伸72℃，5min；溶解曲線72℃→95℃，每20s升溫1℃。結果處理采用ΔΔCT法：A＝CT（目的基因，待測樣本）－CT（內標基因，待測樣本），B＝CT（目的基因，對照樣本）－CT（內標基因，對照樣本），K＝A－B，表達倍數(shù)＝2－K。

5.統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)加減標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組內比較用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.Morris水迷宮法行為學檢測結果

造模前，各組潛伏期時間及跨越平臺次數(shù)無顯著差異（P＞0.05），說明造模前大鼠的認知條件相同；造模后，模型組、假電針組、電針組與造模前比較，大鼠潛伏期時間明顯延長，跨越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.01），說明大鼠去卵巢后大鼠學習記憶能力減低；治療后，電針組大鼠潛伏期時間明顯縮短，跨越平臺次數(shù)明顯增加，與治療前有顯著差異（P＜0.01），且顯著優(yōu)于模型組（P＜0.01），并與假手術組無顯著性差異（P＞0.05）。說明電針能夠提高去卵巢大鼠空間學習記憶能力，逆轉記憶損傷。見表1、2。

表1 各組大鼠Morris水迷宮潛伏期測試成績比較（±s，秒）Table1 Effect of electroacupuncture on latency of each group of rats in morris water maze（±s，sec）

表1 各組大鼠Morris水迷宮潛伏期測試成績比較（±s，秒）Table1 Effect of electroacupuncture on latency of each group of rats in morris water maze（±s，sec）

＊P＜0.01after operation compared with before operation，＃P＜0.01after treatment compared with after operation，＋P＜0.01 compared with sham group，▲P＜0.01compared with model group，△P＜0.01compared with sham EA group

groups n before operation after operation after treatment sham 10 18.20±4.35 16.04±3.53 18.08±4.28 model 10 18.29±3.21 43.35±4.61＊＋ 42.95±4.05＋sham EA 10 19.35±4.74 45.33±5.85＊＋ 33.61±5.62＋?！鳨A 10 19.02±4.78 45.45±5.65＊＋ 19.02±4.79＃▲△

表2 電針對各組大鼠Morris水迷宮跨越平臺數(shù)的影響（±s，次）Table2 Effect of electroacupuncture on the number of acrossing platforms in each group of rats in morris water maze（±s，time）

表2 電針對各組大鼠Morris水迷宮跨越平臺數(shù)的影響（±s，次）Table2 Effect of electroacupuncture on the number of acrossing platforms in each group of rats in morris water maze（±s，time）

＊P＜0.01after operation compared with before operation，＃P＜0.01，＃P＜0.05after treatment compared with after operation，＋P＜0.01compared with sham group，▲P＜0.01compared with model group，△P＜0.01compared with sham EA group

groups n before operation after operation after treatment sham 10 8.69±0.85 8.55±0.99 8.94±0.91 model 10 8.42±0.97 2.56±0.65＊＋ 2.35±0.44＋sham EA 10 8.44±0.85 2.63±0.83＊＋ 3.64±0.88＋?！鳨A 10 8.73±0.79 2.46±0.89＊＋ 8.53±0.83＃▲△

2.電針對去卵巢大鼠血清E2的影響

治療后3個月，模型組大鼠血清E2水平較假手術組顯著下降（P＜0.01），電針組血清E2水平較模型組明顯上升（P＜0.01），但仍未達到假手術組水平（P＜0.01），假電針組雖血清E2水平較模型組有所上升，但仍與假手術組、電針組之間有顯著性差異（P＜0.01）。結果表明電針能夠提高血清E2的水平。見表3。

表3 各組大鼠血清E2濃度比較（±s）Table3 Effect of electroacupuncture on the concentration of serum E2in each group of rats（±s，ng/l）

表3 各組大鼠血清E2濃度比較（±s）Table3 Effect of electroacupuncture on the concentration of serum E2in each group of rats（±s，ng/l）

＋P＜0.01compared with sham group，▲P＜0.01compared with model group，△P＜0.01compared with sham EA group

group n serum E2concentration（pg/ml）sham 10 65.13±7.72 model 10 38.16±5.44＋sham EA 10 49.29±5.90＋▲EA 10 56.47±6.70＋▲△

3.電針對去卵巢大鼠海馬nNOS mRNA的影響

與假手術組比較，模型組大鼠海馬nNOS mRNA表達顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，電針組和假電針組nNOS mRNA表達均有顯著升高，電針組改變更明顯（P＜0.01），但仍未達到假手術組水平（P＜0.01）。結果表明電針能夠上調去卵巢大鼠海馬nNOS mRNA表達。見圖1。

圖1 A：電泳檢測mRNA電泳結果B：各組大鼠海馬nNOS mRNA相對表達量比較（±s）Fig.1 AElectrophoresis mRNA electrophoresis B Effect of electroacupuncture on nNos mRNA expression in hippocampus of each group of rats（±s）

討 論

一氧化氮（NO），一種大腦新的神經(jīng)元信使，通常作為一種神經(jīng)遞質樣分子，容易橫跨細胞膜進行擴散，從而被認為在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮廣泛的功能。NO是一種細胞間的信使，已經(jīng)有大量研究表明其在學習和記憶進程中發(fā)揮關鍵作用，因此被看作是學習和記憶的關鍵調解者。谷氨酸作用于突觸后N－甲基－天門冬氨酸（NMDA）及非NMDA受體，Ca2＋內流進入突觸后與鈣調蛋白（CaM）一起激活NOS，誘發(fā)產(chǎn)生NO。經(jīng)典的途徑為NO作用于靶受體可溶性鳥苷酸環(huán)化酶進而增加細胞內的環(huán)鳥苷酸（cGMP）水平，隨后由cGMP依賴的蛋白發(fā)生磷酸化級聯(lián)反應。NO能擴散至神經(jīng)細胞激活鄰近細胞的鳥苷酸環(huán)化酶，并作為一種信使分子調節(jié)哺乳動物大腦神經(jīng)生理活動行為，如長時程增強（LTP），并已公認通過調整神經(jīng)遞質和神經(jīng)肽的釋放，增加海馬神經(jīng)元的神經(jīng)遞質從突觸前末梢的釋放，激活突觸前和改變突觸活動調節(jié)神經(jīng)遞質的分泌，從而對行為和認知有調節(jié)作用［7］。NO作為逆行信使參與N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）受體介導的長時程增強（LTP），這被認為是一種記憶的突觸模型。數(shù)量驚人的證據(jù)表明NO作為逆行信使，參與海馬突觸可塑性，促進海馬順行和逆行突觸信號和突觸傳輸，參與誘導并完成LTP，從而影響學習和記憶［3］。NO影響記憶的獲得，這個過程被認為與LTP誘導期相關。長時程增強（LTP）認為是學習與記憶的神經(jīng)基礎，是突觸可塑性的功能指標之一。NO供體在海馬樹突狀顆粒細胞的釋放選擇性增加體內樹突微管相關蛋白基因。Hindley［8］等報道NO供體治療的小鼠海馬細胞培養(yǎng)與對照組比較表現(xiàn)出更長、更多的神經(jīng)突起和更高比例的突起神經(jīng)元細胞。這些作者也提供證據(jù)表明通過NO激活鳥苷酸環(huán)化酶增強神經(jīng)生長因子誘導的PC12培養(yǎng)細胞的突起生長，并伴隨著cGMP產(chǎn)生的增加，總之，一些證據(jù)證明：NO促進大腦海馬突觸發(fā)生。值得我們關注的是：NO還具有膽堿能傳遞的調節(jié)作用：L－精氨酸和NO供體減少抑制性突觸的乙酰膽堿（Ach）釋放而增加興奮性突觸Ach釋放，nNOS抑制劑則有相反的影響［9］。NO還可能調節(jié)鈣非依賴性方式的神經(jīng)遞質釋放和傳輸，空間信號，各組神經(jīng)元和神經(jīng)膠質的非突觸傳導，谷氨酸刺激產(chǎn)生的NO誘導附近神經(jīng)元谷氨酸和多巴胺的胞吐和釋放，從而影響突觸可塑性［10］。除了調節(jié)釋放，NO還抑制神經(jīng)遞質的再攝取，特別是有關谷氨酸和多巴胺系統(tǒng)。增強神經(jīng)遞質的釋放和抑制再攝取這兩種影響可以增加神經(jīng)遞質在突觸間隙的可用性，這又可能會影響突觸后受體的調制從而在學習和記憶過程中發(fā)揮作用。

NO是一個性質不穩(wěn)定的“氣體型”小分子，可自由通過細胞膜，通過氧化還原反應發(fā)揮其生物學功能。NO合成后沒有專門的貯存機制，也沒有專門的受體，生成后就向四周擴散并直接透過細胞膜而作用于鄰近細胞，其性質活潑，半衰期極短，在體內生物半衰期僅數(shù)秒鐘，因而目前尚難以對其進行直接測定，而NOS是NO合成過程中的關鍵酶，其活性可間接反映NO的代謝狀況［4］。所以研究NOS在腦內的表達，可為進一步弄清NO在腦內的生理功能提供分子生物學依據(jù)。NO主要有三種類型：神經(jīng)元型（nNOS）、誘導型（iNOS）和內皮細胞型（eNOS），所有類型的NOS在神經(jīng)系統(tǒng)內均存在，但對nNOS的研究更頻繁［11］。nNOS在正常狀態(tài)下表達的活性依賴Ca2＋及鈣調蛋白（CaM），并以少量突發(fā)形式產(chǎn)生NO，發(fā)揮其分子信使等生理功能。nNOS作為逆行信使參與LTP，這個過程在記憶形成中起著關鍵作用。Phung［12］等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)生長因子需要nNOS的存在才能刺激PC12分化。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在逃避學習或接觸空間新事物時，NOS免疫反應性在海馬大大增強［13］。這些發(fā)現(xiàn)表明記憶獲得可能需要上調NOS活性。

Holscher［14］等應用 nNOS抑制劑7－硝基吲唑（7－NI）顯示出受損的空間學習記憶，并因此確定對nNOS的理解作出了重大貢獻。已有研究表明，NOS抑制劑損害SD大鼠的學習記憶，尤其是在較早階段NOS抑制劑抑制NO神經(jīng)元產(chǎn)生從而擾亂動物實驗的記憶過程，NOS抑制劑如N－硝基－L－精氨酸甲酯（L－NAME）阻礙大鼠海馬切片CA1區(qū)LTP的誘導，并在動物幾個學習測試中造成行為損害［15］。Chapman［16］等 觀察大 鼠注射 L－NAME 或L－NARG后，水迷宮測試中表現(xiàn)為失憶癥，而L－精氨酸注射能夠通過爭奪NOS的結合位點阻止LNARG的影響。另外一個重要方面是L－NAME具有與乙酰膽堿受體拮抗的特性，因此阻斷乙酰膽堿受體從而造成學習記憶損傷［17］。NO可改善學習和記憶這一觀點因為NOS抑制劑損害學習和記憶這一事實而被支持。雖然NOS抑制劑對LTP和記憶形成的影響存在矛盾結果，然而NOS參與海馬LTP形成是明確的，這差異是由于學習和記憶任務的形式不同產(chǎn)生的［18］。與藥物抑制劑相似，nNOS的基因抑制在Morris水迷宮測試中表現(xiàn)出空間記憶受損［19］Inglis［20］等報告nNOS基因敲除小鼠運動神經(jīng)元的樹突分支顯著降低。海馬nNOS基因敲除小鼠表現(xiàn)出突觸相關蛋白異常表達［21］。nNOS基因阻斷導致認知功能障礙，運動神經(jīng)元樹突的發(fā)展受損。因此，nNOS基因剔除小鼠在Morris水迷宮測試中受損的空間表現(xiàn)可能是由于海馬的突觸發(fā)生受阻或特定蛋白紊亂，得出任何結論前需要進一步的研究。

已有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可增加腦組織神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS）活性和nNOS mRNA的表達［21］。Grohe［22］等在雌激素長期治療的去卵巢雌性大鼠身上已得到證實：雌激素誘導這些大鼠海馬nNOS表達。有趣的是，有報告表明利用NOS抑制劑L－NAME可能阻礙去卵巢大鼠MWM評估中雌激素介導的空間學習記憶的恢復［23］，這一結果表明NO和雌激素在特定腦區(qū)有相互作用。生化數(shù)據(jù)顯示，nNOS能夠與突觸后支架分子PSD－95結合，形成一個復雜的NMDA受體復合物，這種影響取決于雌激素［24］。此外，雌性小鼠雌激素分泌高峰期，PSD－95表達增加［25］。免疫印跡研究表明去卵巢雌性大鼠接觸到雌激素后nNOS表達亦有變化，實驗條件下在雌性大鼠海馬中，已被證明雌二醇和nNOS之間存在直接關系［22］。已有報道海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元表現(xiàn)出nNOS免疫反應性，而錐體神經(jīng)元在海馬細胞中占主導地位，在海馬CA1和CA3區(qū)錐體神經(jīng)元表達雌激素受體α和β［26］，因此雌激素受體介導的雌激素的作用可能是通過增加NO的生成。雌激素可能通過間接行動影響nNOS，涉及能夠調節(jié)nNOS啟動子的調控因子的干預，例如，雌激素依賴性轉錄因子AP－2、AP－2能誘導幾種基因激活比如雌激素受體，并已發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬存在AP－2表達細胞［27］?；铙w內雌激素水平的生理變化與nNOS表達調控的關系仍不清楚，但是，極有可能依賴多種因素包括雌激素受體分布和共存，雌激素調節(jié)轉錄因子和信號蛋白?？傊?，在這項研究報告的數(shù)據(jù)表明，海馬一氧化氮能神經(jīng)元數(shù)量可能會有所不同，這可能取決于生理條件下雌激素的變化。

本實驗采用Morris水迷宮測試、ELISA以及實時熒光定量的方法分別檢測了去卵巢大鼠行為學、血清雌二醇、nNOS mRNA表達的變化及電針對其的影響。我們采用nNOS的檢測確定NO的作用機制證明了其可行性，使用這一參數(shù)，我們已經(jīng)表明NO在大鼠腦海馬學習記憶過程中有重要作用。結果顯示：Morris水迷宮測試中，模型組大鼠在定位航行實驗中潛伏期比假手術組明顯延長，在空間探索實驗中穿越平臺次數(shù)比假手術組明顯減少。說明去卵巢大鼠的學習記憶能力明顯下降。與治療前相比，治療后電針組與假電針組潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，且電針組改變更明顯。說明從行為學角度評價，電針可改善去卵巢大鼠的學習記憶能力。我們還觀察到模型組大鼠體內雌激素明顯減少的同時，海馬nNOS mRNA表達水平明顯降低，電針組與假電針組雌激素水平上升，其nNOS mRNA表達水平亦明顯升高，且電針組改變更明顯。說明電針能提高體內雌激素水平，并且nNOS mRNA表達受體內雌激素水平變化的影響，提示老年婦女認知功能的減退與體內雌激素水平和海馬nNOS mRNA表達降低有關。這與Funato等［28］報道的雌激素缺乏和雌激素受體的異常，可以影響MCI及AD的發(fā)生和發(fā)展的觀點一致。去卵巢后海馬nNOS mRNA表達顯著下降，電針治療逆轉了這些不利影響，這與Morris水迷宮測試中行為學改善的結果一致。因此這些數(shù)據(jù)表明電針對海馬nNOS mRNA表達的調整與Morris行為學的改變可能存在因果關系。已被證明nNOS與NMDA受體的聯(lián)合依賴雌激素介導，從而提高nNOS的活性，雌激素通過激活NMDA受體增加樹突棘密度，觸發(fā)nNOS表達，誘導NO信號激活，這可能有助于學習和記憶［24］。因此電針可能通過提高雌激素水平，上調nNOS mRNA表達，促進NMDA受體誘發(fā)海馬神經(jīng)元的活性，調節(jié)NO的產(chǎn)生，減少去卵巢引起的學習和記憶損害，這可能是針刺改善老年婦女學習記憶功能的機制之一。這些發(fā)現(xiàn)表明NO確實參與學習記憶的過程，有助于進一步明確NO在記憶過程中的作用。我們的研究也對癡呆病nNOS的異常表達提供了一些證據(jù)，特別是阿爾茨海默氏病。

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