楊 蓓 丁金蘭 陳 雪

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室，沈陽 110001）

Ⅱ型糖尿?。═2D）是由于在胰島素抵抗背景下進行性的胰島素分泌缺陷所造成的，此型占全部糖尿病類型的90－95%；多種因素可以引發(fā)II型糖尿病，如遺傳、不良生活方式、肥胖等，近年流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，環(huán)境砷暴露也可以導(dǎo)致2型糖尿病的高發(fā)［1，2］。實驗研究也表明砷可以通過氧化應(yīng)激來損傷胰島β細胞功能［3］和誘發(fā)胰島素抵抗而導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)病［4］。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是細胞內(nèi)抑制氧化損傷及對抗外來化合物毒性最重要的核轉(zhuǎn)錄因子。因此本實驗考察了亞砷酸鈉對小鼠胰島β細胞的Nrf2和其調(diào)控的抗氧化酶的誘導(dǎo)作用，希望為II型糖尿病發(fā)病及治療提供一個新思路。

材料和方法

1.細胞培養(yǎng)與染毒

小鼠胰島β細胞MIN6由哈佛大學(xué)贈送。培養(yǎng)時應(yīng)用含有15%胎牛血清、5ul/Lβ－巰基乙醇、50umits/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2，95%大氣條件下培養(yǎng)。每2天更換一次培養(yǎng)基。應(yīng)用2、4、6、8、10μmol/L的亞砷酸鈉對MIN6細胞進行染毒6h，同時設(shè)立不加亞砷酸鈉的培養(yǎng)液作為陰性對照。

2.Western Blot

收集細胞，裂解液裂解，超聲處理，低溫離心5 min，取上清液，應(yīng)用BCA方法測定蛋白濃度。選擇4－12%Tris－Glycine凝膠進行電泳，轉(zhuǎn)膜并采用特異性抗體進行western blot分析，一抗：Nrf2（購于Santa Cruz公司）、β－actin（購于Sigma公司）。二抗：堿性磷酸酶標(biāo)記的抗兔、抗小鼠均購自Sigma公司。加入ECF底物進行熒光顯色，使用Typhoon 9410掃描免疫條帶。應(yīng)用Image J分析軟件分析上述結(jié)果，以目的條帶與內(nèi)參β－actin的平均灰度值的比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

3.mRNA提取與Real－time PCR分析

應(yīng)用TRIzol法進行細胞總mRNA提取。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：總mRNA經(jīng)MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶、OligodT和dNTP逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：25℃10min；48℃60min；95℃ 5min。Real－time PCR反應(yīng)：上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用SYBR Green試劑盒（Applied Biosystem公司）和7900HT實時定量PCR儀進行基因轉(zhuǎn)錄水平分析。本實驗中引物設(shè)計應(yīng)用Primer Express軟件（美國Applied Biosystem公司），并由 MWG－BIOTECH公司合成。所用引物為：18S 上游引物：5’CGAACGTCTGCCCTATCAACTT 3’下游引物：5’CCGGAATCGAACCCTGATT 3’；Srx 上 游 引 物：5’GCTTCCTCTCGGGAGTCCTT3’下游引物：5’CAGCAACAGCGACTACGAAGTAA 3’；Gclc上游引物：5’TGGCCACTATCTGCCCAATT 3’下游引物：5’GTCTGACACGTAGCCTCGGTAA 3’。不同組之間基因表達的相對差異應(yīng)用循環(huán)數(shù)（Ct）表示。本實驗中檢測的相關(guān)引物Ct值均小于30。每個樣品的Ct值用1 8s進行校正，mRNA表達量用Ct值與對照組Ct值比較所得的倍數(shù)表示。

4.統(tǒng)計與分析

應(yīng)用統(tǒng)計軟件Graphpad Prism 5進行數(shù)據(jù)處理與分析。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。多組間單個變量比較應(yīng)用單因素方差分析（ANOVA），當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié) 果

1.急性亞砷酸鈉暴露對MIN6細胞Nrf2基因和蛋白表達的影響

應(yīng)用2、4、6、8、10μmol/L的亞砷酸鈉對 MIN6細胞進行染 毒6h，Real－time RT－PCR 結(jié) 果 顯 示：MIN6細胞內(nèi)的Nrf2mRNA表達水平在不同劑量急性亞砷酸鈉暴露6h后均未見顯著變化（圖1）。

圖1 2.4.6.8.10μmol/L亞砷酸鈉暴露6hMIN6細胞Nrf2mRNA（Ct值為21）Fig.1 Nrf2gene expressions of MIN6lells exposed to 2.4.6.8.10μmol/L NaAsO26h（Ct：21）

應(yīng)用2、4、6、8、10μmol/L的亞砷酸鈉對 MIN6細胞進行染毒6h，Western Blot結(jié)果顯示：2μmol/L亞砷酸鈉暴露6h，MIN6細胞內(nèi)Nrf2蛋白表達水平略有升高，4μmol/L亞砷酸鈉則呈現(xiàn)明顯增高（P＜0.05），之后隨亞砷酸鈉劑量的增加而Nrf2蛋白表達逐漸增高，Nrf2蛋白表達存在顯著地劑量依賴性（圖2、3）。

2.急性亞砷酸鈉暴露對MIN6細胞抗氧化酶Srx和Gclc基因表達的影響

應(yīng)用2、4、6、8、10μmol/L的亞砷酸鈉對 MIN6細胞進行染 毒6h，Real－time RT－PCR 結(jié) 果 顯 示：2μmol/L亞砷酸鈉暴露6h，就能夠顯著提高抗氧化酶Srx和Gclc的基因表達，之后隨著亞砷酸鈉染毒劑量的增加，Srx和Gclc的基因表達也隨之增高，呈現(xiàn)了顯著的劑量－效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）（圖4、5）。

圖4 2、4、6、8、10μmol/L亞砷酸鈉暴露6hMIN6細胞Srx mRNA的表達（Ct值為18）.＊P＜0.05，與對照組相比Fig.4 Srx gene expression of MIN6cells exposed to 2、4、6、8、10μmol/L NaAsO2for 6h（Ct：18）.＊P＜0.05，compare with the control group

圖5 2、4、6、8、10μmol/L亞砷酸鈉暴露6hMIN6細胞Gclc mRNA的表達（Ct值為20）.＊P＜0.05，與對照組相比，F(xiàn)ig.5 Gclc gene expression of MIN6cells exposed to 2、4、6、8、10μmol/L NaAsO2for 6h（Ct：20）.＊P＜0.05，compare with the control group

討 論

胰島又稱朗格罕島（islet of Langerhans），分散在于胰腺外分泌部之間，由內(nèi)分泌細胞組成的球形細胞團。胰島主要包含有α、β、δ和PP四種內(nèi)分泌細胞，其中β細胞的主要功能就是合成和分泌胰島素，而胰島素是體內(nèi)唯一的一種降血糖的激素，因此胰島β細胞損傷造成胰島素合成或分泌功能障礙是導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的重要因素之一。氧化應(yīng)激（Oxidative stress）被認(rèn)為是砷發(fā)揮毒性的最重要的機制之一［5］。砷可以在體內(nèi)外誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），如超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等。通常，抗氧化酶在胰島β細胞中呈現(xiàn)低水平表達，這就將導(dǎo)致β細胞對氧化應(yīng)激刺激的防御能力比一般細胞低，所以砷可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)而損傷β細胞的功能，引發(fā)II型糖尿病的發(fā)生。

核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2屬于堿性亮氨酸（bZip）轉(zhuǎn)錄因子CNC家族，是細胞內(nèi)抑制氧化損傷及對抗外來化合物毒性最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，許多化學(xué)物能激活Nrf2、啟動對靶基因的調(diào)控表達。當(dāng)受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf與其胞漿抑制蛋白Keap1解離，并轉(zhuǎn)位進入細胞核，與抗氧化反應(yīng)元件ARE（Antioxidant Response Element）結(jié)合，并介導(dǎo)抗氧化酶，如Srx和Gclc和Ⅱ相解毒酶，如Nqo1、Hmox－1等基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮細胞抗氧化作用［6，7］。

Jingbo Pi［8］在人類HaCaT細胞中首次證明了砷暴露能夠活化Nrf2信號通路。此外，在培養(yǎng)的小鼠3T3L1細胞［4］，Chang 肝細胞［9］等研究中亦表明亞砷酸鈉能夠活化細胞中的Nrf2信號通路，但在胰島β細胞中尚未見相關(guān)報道。本實驗采用來源于轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6胰島素瘤的細胞系MIN6，應(yīng)用了2、4、6、8、10μM 的亞砷酸鈉急性作用 MIN6細胞6h后，結(jié)果顯示細胞內(nèi)Nrf2的mRNA表達并未見顯著改變，而Nrf2蛋白表達則出現(xiàn)了明顯的劑量依賴性；抗氧化酶Srx和Gclc基因表達亦隨亞砷酸鈉劑量的增加而表達增強。綜上所述，亞砷酸鈉能夠在蛋白水平誘導(dǎo)胰島β細胞的核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2蛋白表達，進而促進其下游的抗氧化酶Srx和Gclc基因的轉(zhuǎn)錄活性，并對亞砷酸鈉存在顯著的劑量依賴性。這些結(jié)果表明，亞砷酸鈉能誘發(fā)小鼠胰島β細胞內(nèi)Nrf2/ARE信號通路的激活，來對抗的亞砷酸鈉對細胞造成的氧化應(yīng)激損傷，而Nrf2/ARE信號通路在急性亞砷酸鈉誘導(dǎo)的小鼠胰島β細胞的毒性損傷中的作用及意義還有待進一步研究。

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