黃澄澄 周旭春 劉文秀

（重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，重慶 400016）

結(jié)直腸癌（Colorectal Carcinoma，CRC）在我國發(fā)病率列惡性腫瘤死因的第5位［1］。結(jié)直腸癌的浸潤，轉(zhuǎn)移及早期預(yù)防，早期診斷，早期治療與患者的預(yù)后緊密相關(guān)。

腫瘤的上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）是腫瘤細胞失去上皮細胞的特性，而轉(zhuǎn)化成具有間質(zhì)細胞特性的細胞。ZEB－1（zinc finger E－box－binding protein 1）是一種結(jié)合鋅指蛋白，又稱為TCF8、AREB6或deltaEF1，近年發(fā)現(xiàn)ZEB－1與多種腫瘤發(fā)生，發(fā)展有密切聯(lián)系，并參與了EMT的調(diào)節(jié)過程。ZEB－1在結(jié)直腸癌中的表達情況如何，與臨床病理有何聯(lián)系，國內(nèi)外報道較少。本研究使用免疫組織化學技術(shù)檢測51例結(jié)直腸癌組織中ZEB－1的表達情況，同時聯(lián)合檢測Claudin1和E－cadherin的表達，并探討三者與臨床病理的聯(lián)系及三者之間的關(guān)系。

材料和方法

1.臨床資料

收集2011年3月至2011年12月期間重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普外科行手術(shù)切除的，術(shù)后病理診斷為結(jié)直腸癌的標本51例，同時取相應(yīng)的癌旁組織。全部病例術(shù)前均未接受放療和化療，均無炎癥性腸病病史，均無長期使用非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素史。病理分型及分級按WHO分類標準，分期按TNM標準。其中男30例，女21例，平均年齡61.96歲。結(jié)腸癌20例，直腸癌31例；其中粘液腺癌10例、印戒細胞癌2例、低分化腺癌7例、高和中分化腺癌32例。將高和中分化歸為分化較好的低級別組；將低分化、粘液腺癌和印戒細胞癌歸為分化較差的高級別組。TNM分期：Ⅰ期7人，Ⅱ期20人，Ⅲ期20人，Ⅳ期4人。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)21人，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30人。所有標本取材后經(jīng)多聚甲醛固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋、5μm連續(xù)切片。

2.材料及方法

2.1 主要試劑

Claudin1多克隆抗體 ，購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ZEB－1多克隆抗體，購于美國santa cruz；E－cadherin單克隆抗體、免疫組化試劑盒及顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物有限公司。

2.2 免疫組化染色檢測Claudin1、ZEB－1及E－cadherin表達情況

染色程序嚴格按試劑盒說明書操作。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作空白對照。切片常規(guī)脫蠟，PH9.0EDTA 微波爐加熱修復(fù)抗原，3%雙氧水37℃孵育15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊或兔血清工作液封閉30min，加Claudin1、ZEB－1及E－cadherin一抗（稀釋度均為1∶100）.4℃濕盒中過夜；復(fù)溫1小時，加生物素化二抗37℃孵育30min，以辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素37℃孵育30min，加DAB顯微鏡下顯色，蘇木素復(fù)染細胞核，鹽酸酒精分化，碳酸鋰返藍，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。

2.3 結(jié)果判斷

Claudin1的免疫組織化學陽性結(jié)果判定：每張切片隨機選取5個高倍鏡視野，計數(shù)100個腫瘤細胞中Claudin1陽性的細胞數(shù)積分：＜5% 為0分，5% －24%為1分，25% －50% 為2分，51% －74%為3分，≥75%為4分；陽性細胞著色度積分：無0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；兩項之和0－1分為（－），2－3分為（＋），4－5分為（＋＋），6－7分為（＋＋＋）。（－/＋）為陰性表達，（＋＋/＋＋＋）為陽性表達。E－cadherin陽性結(jié)果判定：無陽性著色或陽性細胞數(shù)＜90% 為陰性表達，陽性細胞數(shù)≥90% 為陽性表達。ZEB－1陽性結(jié)果判定：參考文獻［2］將核陽性著色的腫瘤細胞和非間質(zhì)細胞計為陽性細胞，按著色度積分：無0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；≥1分計為陽性，＜1分計為陰性。

3.統(tǒng)計學方法

使用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計，免疫組化結(jié)果進行卡方檢驗，使用連續(xù)性校正公式或Fisher精確檢驗計算χ2值，并進行spearman相關(guān)性分析，檢驗水準α＝0.05.

結(jié) 果

1.免疫組化染色檢測 Claudin1、ZEB－1和 E－cadherin表達情況

結(jié)直腸癌組織中Claudin1主要為細胞質(zhì)表達，未見細胞核表達.而癌旁組織中Claudin1主要為細胞膜表達（圖1、2）。Claudin1陽性率腫瘤組織（68.62%）高于癌旁組織（37.25%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。ZEB－1主要為腫瘤間質(zhì)細胞核、腫瘤細胞核表達，部分腫瘤組織可見細胞質(zhì)陽性著色（圖5、6、7），ZEB－1陽性率腫瘤組織（23.53%）高于癌旁組織（0），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。E－cadherin主要為細胞膜表達（圖3、4），E－cadherin陽性率腫瘤組織（56.86%）低于癌旁組織（98.0%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.Claudin1、ZEB－1和 E－cadherin蛋白在結(jié)直腸癌中的表達與患者臨床病理聯(lián)系

Claudin1和ZEB－1的表達隨著結(jié)直腸癌TNM分期的增加逐漸增加，Claudin1及ZEB－1的表達率在III－IV期組（87.5%、41.7%）高于I－II期組（51.9%、7.4%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.008，P＝0.007）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（90.9%、45.5%）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（51.7%、6.9%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.005，P＝0.002）。ZEB－1表達率在高級別組（42.1%）高于低級別組（12.5%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.037）。E－cadherin的表達率在I－II期組（74.1%）高于III－IV期組（37.5%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.019）；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（72.4%）高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（36.4%），差異具有統(tǒng)計學意義（P＝0.022）。而Claudin1和E－cadherin的表達率與腫瘤的分級程度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。Claudin1，ZEB－1和E－cadherin的表達率與患者的年齡，性別，腫瘤發(fā)生部位及腫瘤大小等比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

3.結(jié)直腸癌中 Claudin1、ZEB1和 E－cadherin相關(guān)性分析

Claudin1、ZEB1和E－cadherin在結(jié)腸癌中的表達經(jīng)過Spearman相關(guān)分析，Claudin1與E－cadherin的表達，及ZEB－1與E－cadherin的表達均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝－0.302，r＝－0.357（P＝0.032，P＝0.01）。而Claudin1與ZEB－1的表達呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.358（P＝0.01，見表2）。

表1 結(jié)直腸癌中Claudin1、ZEB－1和E－cadherin蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系Table1 The expression and clinical pathological significance of Claudin1，ZEB－1and E－cadherin in colorectal cancer

表2 大腸癌組織中Claudin1、ZEB－1和E－cadherin表達之間的關(guān)系Table2 The relationship of Claudin1、ZEB－1and E－cadherin expression in Colorectal Cancer

討 論

Claudins家族蛋白分子量在20－27kDa，該家族分子都存在四個疏水跨膜區(qū)域，在細胞外形成兩個外環(huán)，C末端在細胞內(nèi)與閉鎖小帶蛋白（ZO－1，ZO－2，ZO－3）連接，相鄰細胞間2個外環(huán)相連，細胞被此種結(jié)構(gòu)分成頂側(cè)區(qū)和基側(cè)區(qū)，具有柵欄屏障功能，對身體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著重要作用。人們認識較多的是Claudin1，有研究發(fā)現(xiàn)Claudin1的異常表達與肝癌，骨肉瘤和黑色素瘤等腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［3］。本研究中發(fā)現(xiàn)Claudin1在腫瘤組織的的表達率（68.62%）高于癌旁的表達率（37.25%），差異具有顯著性。Claudin1在腫瘤組織中主要是細胞質(zhì)表達，與文獻報道相似［4］。但本研究Claudin1在結(jié)直腸癌細胞核未見表達與Dhawan研究Claudin1在結(jié)直腸癌細胞核表達也有增加略有差異［5］，原因可能是樣本量較小或是選用的試劑廠家差別造成的。隨腫瘤分期的增加Claudin1的表達率增加，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異具有顯著性。Claudin1的異常表達，可能導(dǎo)致細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞和重組，細胞失去極性，滲透性增加，利于營養(yǎng)物質(zhì)運輸，促進腫瘤的生長及遷移。E－cadherin做為一種抑制腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移的蛋白，E－cadherin表達降低是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標志。本研究發(fā)現(xiàn)，在51例癌旁組織中，E－cadherin主要位于細胞膜上，表達率為98%，而在腫瘤組織中E－cadherin的表達率降低，為56.86%，且其表達率隨著結(jié)直腸癌的分期增加而減少，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組表達率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。有學者發(fā)現(xiàn)，在SW480結(jié)腸癌細胞中，Claudin1表達升高可以導(dǎo)致細胞膜上E－cadherin表達降低，通過沉默SW620結(jié)腸癌細胞中Claudin1的基因，可導(dǎo)致E－cadherin基因的啟動子區(qū)域活性增加2.5－6倍，增加 E－cadherin mRNA 水平［5］。本研究進一步在蛋白質(zhì)水平研究發(fā)現(xiàn)，Claudin1與E－cadherin呈負相關(guān)關(guān)系，提示Claudin1的異常表達、E－cadherin水平降低與結(jié)直腸癌的生物學行為有關(guān)。

snail超家族包括snail、slug、ZEB－1、ZEB－2等，鋅指E盒結(jié)合蛋白1（ZEB－1）是其中一員，基因位于人類10號染色體短臂上，含有兩個鋅指結(jié)構(gòu)簇及一個同源結(jié)構(gòu)域。近年來研究發(fā)現(xiàn)在某些腫瘤中，如乳腺癌，骨肉瘤，胃癌中，ZEB－1做為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，在腫瘤細胞的EMT轉(zhuǎn)換中起了重要作用，ZEB－1可能增加腫瘤細胞的遷移能力［6－9］。在結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1可促進結(jié)腸癌細胞的遷移，失去上皮細胞極性因子，即幼蟲巨大致死性基因2（Lethal giant larvae 2，LGL2），使細胞失去極性［10］。在肺腺癌細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過慢病毒敲除ZEB－1可在體內(nèi)和體外抑制腫瘤細胞的生長［11］。ZEB－1在細胞的定位，文獻報道有差異。有研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌組織中，ZEB－1主要表達于腺癌細胞核和細胞質(zhì)中［11］；而在膀胱癌組織中，ZEB－1主要表達于腫瘤組織上皮細胞核及間質(zhì)細胞核中［12］；還有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中，腫瘤上皮細胞不表達ZEB－1，只表達于間質(zhì)細胞中［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，ZEB－1主要表達于腫瘤的間質(zhì)細胞核和腫瘤細胞核中，部分表達于腫瘤細胞胞質(zhì)中。本研究參考文獻［2］將核陽性著色的腫瘤細胞和非間質(zhì)細胞計為陽性細胞。ZEB－1在腫瘤組織的表達率（23.53%），明顯高于癌旁組織，在III－IV期組高于I－II期組，并且ZEB－1表達率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示ZEB－1可能參與了腫瘤細胞的遷移過程。Aigner研究發(fā)現(xiàn)，ZEB－1在腫瘤的浸潤前沿表達增多，并可抑制腫瘤細胞的分化［14］。本研究顯示，ZEB－1的表達率與結(jié)直腸癌的分化程度相關(guān)，ZEB－1的表達率隨著結(jié)直腸癌組織的分化程度的降低而增加，表明ZEB－1可能參與了腫瘤細胞的去分化過程。該結(jié)果與Aigner的研究存在某種程度上的一致性。ZEB－1的表達率與患者的性別，年齡，腫瘤的大小及腫瘤組織的部位比較，差異無統(tǒng)計學意義。ZEB－1可能抑制 E－cadherin的表達，ZEB－1的側(cè)翼鋅指E族可以與E－cadherin啟動子序列上的E盒序列的 DNA（CACCT/G）結(jié)合［15］，阻止其啟動，降低E－cadherin的轉(zhuǎn)錄。在胰腺癌細胞研究中發(fā)現(xiàn)，ZEB－1可通過募集組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）于 E－cadherin啟動子上，而抑制E－cadherin轉(zhuǎn)錄［16］。Joo JH 等認為，ZEB－1可通過結(jié)合依賴和非結(jié)合依賴的作用，與C區(qū)結(jié)合蛋白（C－terminal Binding Protein.CtBP）形成復(fù)合體，在CtBP存在的情況下，可抑制E－cadherin的表達［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，ZEB－1的表達與 E－cadherin的表達在蛋白水平上呈負相關(guān)關(guān)系，ZEB－1可能抑制E－cadherin的表達，導(dǎo)致上皮間連接破壞，從而腫瘤細胞更易遷移。

目前，對 Claudin1、ZEB－1及，E－cadherin在結(jié)直腸癌的浸潤，轉(zhuǎn)移中的相互關(guān)系研究較少。有學者使用熒光素追蹤發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染Claudin1的細胞中，ZEB－1啟動子活性增加4－5倍。在SW480和SW620結(jié)腸癌細胞系中，發(fā)現(xiàn)增加Claudin1的表達可引起ZEB－1的增加，E－cadherin的減少，而不影響snail1和snail2的表達，使用選擇性抑制劑阻止Akt的磷酸化或使β－catenin發(fā)生突變而降低wnt通路的活性，都可降低Claudin1對ZEB－1的調(diào)節(jié)［18］，因而推測Claudin1的表達增加通過wnt通路或PI－3K通路，使得ZEB－1的表達增加，從而減少了 E－cadherin的合成，即存在 Claudin1/ZEB－1/E－cadherin軸［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，從體內(nèi)研究，在蛋白質(zhì)水平上發(fā)現(xiàn)，ZEB－1與Claudin1呈正相關(guān)關(guān)系，Claudin1、ZEB－1與 E－cadherin呈負相關(guān)關(guān)系，本實驗研究結(jié)果與前人的體外研究結(jié)果相似。Claudin1和E－cadherin的細胞膜表達量減少可能降低腫瘤細胞間的粘附力，使腫瘤細胞失去上皮細胞極性，導(dǎo)致腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使腫瘤細胞更容易浸潤和轉(zhuǎn)移。Claudin1、ZEB－1、E－cadherin三者之間協(xié)同作用，有利于腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，與腫瘤的預(yù)后有關(guān)。三者的聯(lián)合檢測將有利于臨床上預(yù)測患者的預(yù)后并為結(jié)腸癌的基因治療提供新的方法和策略，值得進一步研究。

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