章福彬，朱 斌，唐 郡，劉 衛(wèi) (解放軍第105醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽合肥 230000)

Musashi是一種RNA結(jié)合蛋白，最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，在維持干細(xì)胞狀態(tài)、分化和腫瘤發(fā)生方面起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)通過RNAi技術(shù)調(diào)控人HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞Musashi-1基因表達(dá)水平，并檢測(cè)干擾后細(xì)胞生物學(xué)行為的改變，探討Musashi-1基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，為探討結(jié)腸癌中Musashi基因的功能提供新的手段。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與主要試劑

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116由本實(shí)驗(yàn)室保存，干擾質(zhì)粒載體pGenSil-1購于武漢晶賽公司;Musashi-1 siRNA序列由上海吉?jiǎng)P公司合成，LipofectamineTM 2000 Reagent轉(zhuǎn)染試劑和AnnexinV凋亡試劑購于Invitrogen公司，總RNA提取試劑(Trizol)和real time PCR試劑盒購于TaKaRa公司。

1.2 Musashi-1siRNA靶序列的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank的Musashi-1 mRNA(NM_002442)全長序列，按siRNA原則設(shè)計(jì)，經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫分析未發(fā)現(xiàn)同源序列。設(shè)計(jì)基因靶點(diǎn)分別于Musashi-1基因的第205、741位點(diǎn)，靶序CCGGAGTTA。將化學(xué)合成的正義鏈和反義鏈退火，與經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶切后線性化pGeneSil-1載體連接，經(jīng)篩選、酶切鑒定后測(cè)序。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116接種于含10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的培養(yǎng)基中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，取對(duì)數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以合適的細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板，用含10%血清不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液、37℃、5%CO2溫育過夜，次日轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染操作按LipofectamineTM 2000 Reagent說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24 h后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞按1∶10稀釋，將其種植于另一培養(yǎng)板，再經(jīng)過24 h后，向培養(yǎng)液中加入400 μg/mL的G418進(jìn)行抗性篩選，2周后熒光顯微鏡下可見細(xì)胞克隆發(fā)出熒光，對(duì)陽性克隆進(jìn)行有限稀釋，擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。

1.4 Real time PCR 檢測(cè)

按Trizol法提取總RNA，據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法獲得單鏈cDNA，取cDNA作為模板進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。采用嵌合熒光檢測(cè)法，采用50μl反應(yīng)體系(2×SYBR Premix Ex TaqTM 25 μl，上游引物 1 μl，下游引物 1 μl，50 × ROX Reference Dye 1 μl，cDNA，溶液4 μl，DEPCH2O 18 μl)95 ℃預(yù)變性180 s;95℃ 20 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。用 pGEM-Musashi質(zhì)粒和pGEM-GAPDH質(zhì)粒，系列稀釋同時(shí)擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。記錄各管擴(kuò)增CT值，換算出基因拷貝數(shù)。以Musashi基因拷貝數(shù)與GAPDH基因拷貝數(shù)的比值作為其相對(duì)表達(dá)水平，Musashi引物序列為:正義5'-GTTTCGGCTTCGTCACTTTC-3'，反義5'-GAGTCACCATCTTGGGCTGT-3';GAPDH引物序列為:正義5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，反義 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長曲線

將轉(zhuǎn)染后的干擾組、空載體組細(xì)胞制備成3×103個(gè)細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天取一板進(jìn)行MTT反應(yīng)，每孔分別加入5 mg/mLMTT 20μl，37℃孵育4 h后棄去上清，每孔均加入二甲基亞砜100μl，輕微振蕩使紫藍(lán)色沉淀溶解。用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長處的吸光度(D)，計(jì)算細(xì)胞的抑制率。細(xì)胞生長抑制率(%)=［(對(duì)照組A490 nm－實(shí)驗(yàn)組A490 nm)/對(duì)照組A490 nm］×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

轉(zhuǎn)染后的干擾組、空載體組細(xì)胞接種于6孔板中，收集轉(zhuǎn)染后擴(kuò)增的細(xì)胞和空載體組細(xì)胞各1×106個(gè)，70%冰乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色，測(cè)定細(xì)胞周期情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Musashi siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定及觀察

測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入寡核苷酸序列與設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列完全吻合，說明重組載體構(gòu)建成功。質(zhì)粒中含有編碼GFP的基因，故轉(zhuǎn)染細(xì)胞在熒光顯微鏡下可激發(fā)出綠色熒光(圖1)。

圖1 G418抗性篩選后陽性克隆熒光倒置顯微鏡檢測(cè)結(jié)果

2.2 Musashi siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞Musashi mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:siRNA-1組及siRNA-2組的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為(0.37±0.040)和(0.33±0.025)，與空載體對(duì)照組(0.87 ±0.034)比較，siRNA1 ～siRNA2均可下調(diào)Musashi mRNA的表達(dá)，siRNA-1～siRNA-2間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

圖2 Real time PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 Musashi siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

Musashi siRNA 轉(zhuǎn)染 HCT116 細(xì)胞后 1、2、3、4 d與對(duì)照組比較，siRNA-1、siRNA-2組細(xì)胞增殖減慢。細(xì)胞轉(zhuǎn)染2 d后的抑制率較1 d顯著增加，但4 d的抑制率較3 d增加不明顯，轉(zhuǎn)染4 d后抑制率較前下降。空載體對(duì)照組細(xì)胞的抑制率無明顯變化(圖3)。

圖3 Bim-1 RNAi對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

2.4 Musashi siRNA對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響

與空載體組細(xì)胞比較，干擾組細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯，在S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)下降，以上結(jié)果提示Musashi的RNA干擾可以使HCT116細(xì)胞停滯于G0/G1期，明顯抑制HCT116細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，見表1。

表1 Musashi siRNA 對(duì)HCT116細(xì)胞周期分布影響±s，%)

表1 Musashi siRNA 對(duì)HCT116細(xì)胞周期分布影響±s，%)

空載體組45.36 ±4.5640.11 ±3.2414.09 ±6.12 siRNA-180.35 ±4.3315.69 ±2.364.90 ±1.68 siRNA-282.36 ±3.6814.39 ±3.823.78 ±4.71

3 討論

干細(xì)胞是一類具有自我更新和增殖分化潛能的原始細(xì)胞，近年來提出在腫瘤的瘤體內(nèi)也存在與干細(xì)胞具有相似生物學(xué)活性的一類細(xì)胞群體，科學(xué)家命名這種存在于腫瘤細(xì)胞群體中的特殊細(xì)胞為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell)［1］，腫瘤干細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用，它位于腸黏膜隱窩基底部［2］，與腸道腫瘤的形成密切相關(guān)，有研究表明結(jié)腸癌的形成是通過持續(xù)性基因突變產(chǎn)生的，這種基因突變可能發(fā)生在腸道干細(xì)胞水平。

結(jié)腸癌是我國常見惡性腫瘤，其預(yù)后不良，早期診斷可以提高患者生存率。作為腸道干細(xì)胞的特異性分子標(biāo)記之一的Musashi-1越來越受到人們的重視。人Musashi-1由362個(gè)氨基酸組成，N端含有2個(gè)保守的RRM(RNA Recognize Domain)結(jié)構(gòu)域。Musashi家族分子能夠在多個(gè)層面上決定細(xì)胞命運(yùn)，包括維持干細(xì)胞的狀態(tài)、細(xì)胞的分化和腫瘤的發(fā)生等［3］。蘇沐等［4］認(rèn)為正常腸道干細(xì)胞標(biāo)記物Musashi-1有可能成為結(jié)直腸癌干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞特異性標(biāo)記，龔劍峰等［5］則對(duì)Musashi-1啟動(dòng)子進(jìn)行了克隆及功能分析，為應(yīng)用該啟動(dòng)子進(jìn)行腸道干細(xì)胞的分離和純化提供條件。趙曄等［6］采用免疫組織化學(xué)對(duì)正常的胃黏膜、小腸黏膜及降結(jié)腸黏膜中musashi-1、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)、Oct-4和Nestin的表達(dá)情況進(jìn)行研究，認(rèn)為Musashi-1是胃腸道相對(duì)特異的干細(xì)胞標(biāo)記物。本研究則是構(gòu)建了Musashi-1的兩個(gè)siRNA真核表達(dá)載體(siRNA-1、siRNA-2)，轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116細(xì)胞，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定Musashi-1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，siRNA-1、siRNA-2均能抑制Musashi-1的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用MTT和流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞的生長曲線和周期分布，發(fā)現(xiàn)Musashi-1siRNA能夠使細(xì)胞增殖速度減慢，并使細(xì)胞停滯于G0/G1期。

總之，本研究通過使用靶向Musashi-1的siRNA，有效抑制了Musashi-1基因在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，還能在體外特異性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的分裂增殖，為探討結(jié)腸癌中Musashi基因的功能提供新的手段。

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