婁立起，田璨熙，李 磊，譚 軍，吳永堯

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

芝麻粕是芝麻取油后的副產(chǎn)品，我國作為芝麻生產(chǎn)大國，僅芝麻餅粕的年產(chǎn)量就在50萬t以上，資源十分豐富[1]。芝麻粕中，蛋白質(zhì)平均含量在40%～46%，氨基酸的含量也十分豐富[2-4]，營養(yǎng)價(jià)值高[5-7]，尤其是幾種主要必需氨基酸如蛋氨酸、蘇氨酸、精氨酸、色氨酸含量均高于其他餅粕[2]。目前對油料蛋白的利用研究主要集中在豆粕、油菜籽粕[8]和面籽粕，對芝麻粕蛋白的利用[9-12]研究較少。芝麻粕降解菌可利用芝麻粕作有機(jī)肥料，通過對芝麻粕的降解使得餅粕中的大分子蛋白降解成小分子肽段或氨基酸。筆者從自然界廣泛篩選芝麻粕降解菌，并進(jìn)行誘變和發(fā)掘條件優(yōu)化，旨在為芝麻粕降解菌在農(nóng)業(yè)上的生產(chǎn)利用提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 土壤和水樣。采集時(shí)間為2011年4月，土壤、水樣分別采集自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻基地、食堂下水道，采集后的樣品裝入三角瓶中。

1.1.2 培養(yǎng)基 初篩培養(yǎng)基：芝麻粕50 g/L，121℃滅菌25 min；酪素平板培養(yǎng)基：干酪素1 g/L，溶解，加水定容至100 mL并調(diào)pH值為7，瓊脂2%；種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，自然pH值；搖瓶培養(yǎng)基：芝麻粕50 g/L，121℃滅菌25 min。LB肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂 20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 菌株的篩選 （1）初篩方法：將采集的水樣（95∶5） 和土壤 （1∶1） 分別加入初篩培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min條件下于搖床中培養(yǎng)5 d。將發(fā)酵液用無菌水梯度稀釋，滴加0.1 mL涂布于酪素平板培養(yǎng)基篩選，取透明圈大的菌株接種于斜面，進(jìn)行復(fù)篩。（2）復(fù)篩方法：將斜面保存的初篩菌株接入種子培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min條件下于搖床中培養(yǎng)24 h，取5 mL接種于搖瓶培養(yǎng)基中，同樣條件下培養(yǎng)48 h[13]。

1.2.2 酶活力及生物量的測定 （1）蛋白酶活力的測定：采用福林酚法[14]，酶活力定義為1 mL液體酶在40℃和pH值為7的條件下，1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸為1個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。（2）生物量的測定：采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.2.3 菌株的鑒定 取復(fù)篩后的菌株接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，提取DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增的2個(gè)引物分別為27F （正向引物）：5′—AGAGTTTGATC（C/A）TG2GCTCAG—3′；1492R（反向引物）：5′—GGTTACCTTGTTACGACTT—3′。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行基因序列測定。

將上述菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行Blast比對，分析序列同源性，使用ClustalX1.83軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的細(xì)菌16S rRNA序列進(jìn)行多序列匹配排列（Multiple Alignments），采用鄰接法（Neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 菌株的誘變 用10 mL無菌生理鹽水洗脫出發(fā)菌株斜面，打散菌體后稀釋至102個(gè)/mL菌懸液，在紫外燈下進(jìn)行誘變，15 W、254 nm紫外燈30 cm 照射。設(shè)置照射時(shí)間分別為 0、20、40、60、80、120、140 s。吸取照射后菌懸液0.1 mL涂布于酪素平板37℃避光培養(yǎng)48 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

菌種初篩后得到146株可降解芝麻粕的菌株，通過透明圈大小的比較選取30株進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表1所示。這些菌株的生物量維持在2.5×108～12.1×108cfu/mL，酶活力在 97～355 U/mL，其中菌株7的酶活力達(dá)352.436 U/mL，因此選用菌株7進(jìn)行下一步研究。

表1 初篩菌種發(fā)酵后的酶活及生物量

2.2 菌株的鑒定

復(fù)篩出的菌株7的16S rRNA基因序列長度為1 447 bp，將該菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行NCBI的Blast檢索系統(tǒng)同源性檢索，結(jié)果表明，該菌株與芽孢菌屬等細(xì)菌的16S rRNA基因序列自然聚類。在檢索出的芽孢桿菌序列中，該菌株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的同源性達(dá)99%。根據(jù)該菌16S rRNA基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析的結(jié)果，判斷將其為枯草芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌。

2.3 菌株的誘變

圖1 LQ16S rRNA基因進(jìn)化樹

將出發(fā)菌株7在紫外照射不同時(shí)間，結(jié)果如圖1所示，隨著照射時(shí)間的延長，致死率逐漸增大，40 s時(shí)致死率為86.6%，選取40 s為誘變劑量。菌株經(jīng)誘變后，從平板上挑選26株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，部分菌株蛋白酶發(fā)酵后結(jié)果如圖2所示，菌株4的酶活力明顯高于其他菌株，酶活力達(dá)587.3 U/mL。選取保存該菌株，并命名為LQ。

圖2 紫外誘變致死曲線

圖3 誘變后菌株酶活力

3 討論

菌株LQ經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析確定為解淀粉芽孢桿菌，它是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌。在其自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，如葡萄糖苷酶、淀粉酶以及蛋白酶等，有些代謝產(chǎn)物使解淀粉芽孢桿菌能夠具有廣泛抑制真菌和細(xì)菌的活性[15]。以解淀粉芽孢桿菌為出發(fā)菌株降解芝麻粕粗蛋白的應(yīng)用尚未見詳細(xì)報(bào)道，菌株LQ對芝麻粕中粗蛋白有較好的降解作用，拓寬了解淀粉芽孢桿菌的應(yīng)用范圍。

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