張建威，李苗云，趙改名，許 雄，田 瑋，柳艷霞，高曉平

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450002)

雞骨渣是雞骨通過骨肉分離機(jī)后排出的廢渣，價(jià)格低廉，但它含有大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的肉類加工副產(chǎn)品，潛在的應(yīng)用價(jià)值很大［1］．目前用于深加工的雞骨不足總量的2%，雞骨渣的綜合利用率更低，大量的雞骨渣資源得不到利用，不但浪費(fèi)大，還導(dǎo)致環(huán)境污染［2］．由于雞骨本身帶有的腥味及其粉碎后的顆粒感，是企業(yè)利用雞骨渣資源面臨的重要問題之一．生物酶解技術(shù)能水解骨渣上的肉類蛋白，使骨肉分離，制備功能性肉類提取物，從而提高加工副產(chǎn)品的附加值，是深度開發(fā)和綜合利用雞骨渣資源的可行途徑［3］．木瓜蛋白酶具有價(jià)格便宜，反應(yīng)溫度低，作用底物廣泛等特點(diǎn)［4，5］，研究和優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解雞骨渣的工藝條件對雞骨渣的綜合利用具有重要意義，也為企業(yè)尋找新的突破口提供技術(shù)支持．目前應(yīng)用酶解技術(shù)實(shí)現(xiàn)骨肉分離或利用部分軟骨的研究較多［6～12］，而對雞骨渣的酶解優(yōu)化研究很少．對木瓜蛋白酶在肉的嫩化、膠原蛋白的提取和制備等方面有較多研究［13～14］，但對雞骨渣的酶解研究較少．因此，本研究以雞骨渣為對象，研究木瓜蛋白酶的水解條件，并對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為企業(yè)提供一定的技術(shù)支持．

1 材料與方法

1．1 主要試驗(yàn)材料和儀器

1．1．1 試驗(yàn)材料 從某公司原料庫同批同質(zhì)隨機(jī)3～5件上取雞骨若干小塊，共約2 kg，經(jīng)充分混合均勻后，備用．木瓜蛋白酶(60萬U·g－1)由比利時(shí)PSM有限公司提供．

1．1．2 主要試劑與儀器 試劑均為國產(chǎn)分析純試劑．3205型食品加工機(jī)(博朗電器，匈牙利)，YXQGOI型蒸汽消毒器(山東新華醫(yī)療器械廠)．

1．2 雞骨渣的酶解與處理

取混勻后新鮮雞骨樣品50 g，放入三角瓶中，加入一定量的水，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的溫度和時(shí)間，在水浴恒溫振蕩器中進(jìn)行酶解．酶解完畢，于90℃15 min滅酶，之后將樣品水洗沖渣過濾，一并轉(zhuǎn)入250 mL的容量瓶中，定容，獲得酶解液和酶解的殘?jiān)畬⑹Ｓ嗟臍堅(jiān)?5℃，自然晾干2 h后稱重，記錄殘?jiān)馁|(zhì)量．

1．3 酶解參數(shù)的單因素試驗(yàn)

在預(yù)試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)pH值和加水量對雞骨渣酶解效果的影響不大．因此，本試驗(yàn)分別以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶底物比為主要因素進(jìn)行全因子實(shí)驗(yàn)，確定木瓜蛋白酶各因素的取值范圍．由于底物的單一性，酶底物比以加酶量表示，即以投放的酶量占原料雞骨渣量的百分比．以水解度和殘?jiān)繛橹饕u價(jià)指標(biāo)．

1．4 酶解參數(shù)的優(yōu)化

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件進(jìn)行3因素Box-Benhnken設(shè)計(jì)，產(chǎn)生17個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素、水平及編碼參照單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行．分別以總氮回收率Y1、水解度Y2、殘?jiān)縔3綜合確定最佳酶解反應(yīng)參數(shù)．

1．5 中試驗(yàn)證

對優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行40 kg中試驗(yàn)證，分別以水解度、殘?jiān)俊⒖偟厥章蕿樵u價(jià)指標(biāo)．

1．6 分析方法

1．6．1 殘?jiān)康臏y定 殘?jiān)恐该附夂笫Ｓ鄽堅(jiān)馁|(zhì)量占酶解雞骨渣樣品質(zhì)量的百分含量，該指標(biāo)在一定程度上反映了骨肉分離的效果．酶解后，將剩余殘?jiān)?5℃自然晾干2 h后稱重，即為殘?jiān)浚?/p>

1．6．2 水解度的測定 根據(jù)Alder-Nissen的計(jì)算方法測定水解度［15］(Degree of hydrolysis，DH)．

1．6．3 總氮回收率

溶液性總氮:取經(jīng)充分混勻的酶解液5 mL，于水浴風(fēng)干，采用ISO 937—1978(E)方法測定總氮含量;總氮:按ISO 937—1978(E)方法進(jìn)行，表示為總氮．

1．7 數(shù)據(jù)處理

單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 15．0處理，響應(yīng)曲面采用Design-Expert 7．0進(jìn)行分析．

2 結(jié)果與分析

2．1 不同工藝酶解雞骨渣的效果

2．1．1 溫度對雞骨渣酶解效果的影響 選取加酶量為 0．1%，加水量為 1g·g－1樣品，pH 值為 7，時(shí)間為2 h，分別在50，55，60，65，70，75 ℃下水解，結(jié)果見圖1．

圖1 溫度對水解度和殘?jiān)康挠绊慒ig．1 Effect of temperature on hydrolysis degree and remains

由圖1可以看出，反應(yīng)溫度太低，酶活力不足，水解較慢，反應(yīng)不完全;當(dāng)溫度較高時(shí)，部分酶失活，水解不完全．反應(yīng)溫度在65℃時(shí)，蛋白酶水解度最高，殘?jiān)孔钌伲?/p>

2．1．2 加酶量對雞骨渣酶解效果的影響 選取加酶量分別為 0．03%，0．06%，0．09%，0．12%，015%，0．18%，溫度為 65 ℃，加水量為1 g·g－1，pH值為7，酶解時(shí)間為2 h(圖2)．從圖2可以看出，加酶量在0．03% ～0．12%，水解度上升趨勢明顯，脫肉效果明顯增強(qiáng)，殘?jiān)繙p少．但到 0．12%以上，無論是水解度，還是殘?jiān)孔兓厔萜骄彛畯慕?jīng)濟(jì)角度考慮，確定0．1%為最佳酶用量．

圖2 加酶量對水解度和殘?jiān)康挠绊慒ig．2 Effect of enzyme concentration on hydrolysis degree and remains

2．1．3 時(shí)間對雞骨渣酶解效果的影響 選取水解時(shí)間為 0．5，1，1．5，2，2．5，3 h，溫度為 65 ℃ ，加水量為 1 g·g－1，pH 值為 7，加酶量為 0．1%(圖 3)．從圖3可以看出，隨著時(shí)間的延長，0～3 h內(nèi)的水解度上升趨勢明顯，而到2 h時(shí)，殘?jiān)孔兓厔萜骄彛紤]生產(chǎn)效率和脫肉效果，時(shí)間控制在2 h之內(nèi)最佳．

2．2 酶解工藝條件的優(yōu)化

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Design-Expert軟件對溫度、加酶量和酶解時(shí)間進(jìn)行了3因素Box-Benhnken設(shè)計(jì)，產(chǎn)生17個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平及編碼見表1，溫度、加酶量和時(shí)間分別以X1，X2，X3表示．響應(yīng)曲面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，總氮回收率、水解度和殘?jiān)糠謩e以Y1，Y2，Y3表示．

圖3 酶解時(shí)間對水解度和殘?jiān)康挠绊慒ig．3 Effect of time on hydrolysis degree and remains

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the experiments

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface design and results

2．2．1 酶解工藝對總氮回收率的影響 從表3可以看出，總氮回收率回歸模型有意義(P＜0．000 1)．溫度、酶解時(shí)間和加酶量對總氮回收率的影響均顯著(P ＜0．05)．信噪比為14．84，失擬項(xiàng)為0．625 3，模型的校正擬合系數(shù) R2為0．896 9，表明由誤差引起的失擬不顯著，模型擬合度較好．

采用逐步回歸法得出酶解條件對總氮回收率的優(yōu)化方程，方程如下:

溫度和加酶量對總氮回收率影響的響應(yīng)曲面如圖4．隨著加酶量的增加，總氮回收率呈增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)加酶量增大到0．12%時(shí)，對總氮回收率的貢獻(xiàn)漸漸減弱．而溫度對總氮回收率的的影響較為復(fù)雜，從等高線可以明顯看出，溫度在58℃至接近65℃之間時(shí)，總氮回收率隨溫度增加而增強(qiáng)，超過65℃總氮回收率開始下降，并且溫度越高水解度下降越快，這種變化受時(shí)間變化的影響很小．

圖4 溫度和加酶量對總氮回收率的影響Fig．4 Effects of temperature and enzyme concentration on the TN recovery

表3 總氮回收率回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA analysis of regression model of TN recovery

2．2．2 酶解工藝對水解度的影響 由表4可以看出，水解度回歸模型有意義(P＜0．0001)，溫度、酶解時(shí)間和加酶量對水解度的影響均顯著．信噪比為13．331，失擬項(xiàng) P=0．4850 ＞0．05，模型的校正擬合系數(shù)R2為0．8872，表明由誤差引起的失擬不顯著，該模型擬合度比較好．

采用逐步回歸法得出時(shí)間、溫度和加酶量對水解度的優(yōu)化方程如下:

表4 水解度回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA analysis of regression model of DH

溫度和加酶量對水解度影響的響應(yīng)曲面如圖5．加酶量在0．6% ～0．8%時(shí)，水解度隨著時(shí)間的增加而增加，而當(dāng)加酶量大于0．1%時(shí)，水解度變化趨于平穩(wěn)．溫度對水解度的影響與對總氮回收率的影響類似，當(dāng)溫度由低升高至55℃左右時(shí)，水解度逐漸增大，而溫度繼續(xù)增大時(shí)，水解度急劇的下降．

2．2．3 酶解工藝對殘?jiān)康挠绊?由表5可以看出，殘?jiān)康幕貧w模型顯著(P＞0．01)．溫度、酶解時(shí)間和加酶量對殘?jiān)康挠绊懢@著．信噪比為9．404，失擬項(xiàng) P ＞0．05，表明由誤差引起的失擬不顯著，該模型擬合度較好．

采用逐步回歸法得出時(shí)間、溫度和加酶量對殘?jiān)康膬?yōu)化方程如下:

圖5 溫度和加酶量對水解度的影響Fig．5 Effects of temperature and enzyme concentration on the degree of hydrolysis

表5 殘?jiān)炕貧w模型方差分析結(jié)果Table 5 ANOVA analysis of regression model of content of remains

溫度和時(shí)間對殘?jiān)坑绊懙捻憫?yīng)曲面如圖6．由圖6可以看出，溫度和時(shí)間對殘?jiān)坑泻軓?qiáng)的交互作用，當(dāng)水解時(shí)間較短在1～1．5 h時(shí)，溫度對殘?jiān)康挠绊懗尸F(xiàn)反向的拋物線型，在58～63℃，隨著溫度的增加，水解效果越強(qiáng)，殘?jiān)拷档停?dāng)溫度繼續(xù)上升至68℃時(shí)，殘?jiān)恳搽S之上升。從等高線可以看出，當(dāng)水解時(shí)間較長，大于1．75 h，隨著溫度的上升，殘?jiān)恳恢背尸F(xiàn)下降的趨勢．

圖6 溫度和時(shí)間對殘?jiān)康挠绊慒ig．6 Effects of temperature and time on the content of remains

2．3 優(yōu)化的工藝參數(shù)驗(yàn)證

分別對總氮回收率最大、殘?jiān)孔钌?、水解度最高?者綜合考慮，對優(yōu)化的酶解工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表6所示．

殘?jiān)?、水解度和總氮回收率真?shí)值與預(yù)測值之間分別具有 88．2%，95．0%，86．5%的相關(guān)性，相關(guān)性較好，可以利用上述優(yōu)化方程方程對實(shí)際酶解過程進(jìn)行預(yù)測和控制．第1和3組進(jìn)行40 kg的中試時(shí)，產(chǎn)品骨肉分離干凈，殘?jiān)枯^低，分別為24．52%和24．50%，與小試結(jié)果基本一致．考慮企業(yè)的實(shí)際操作和條件，確定木瓜蛋白酶酶解優(yōu)化的參數(shù)為:溫度為65℃，加酶量在0．1%，反應(yīng)時(shí)間1．8 h，自然pH值和1∶1的料液比．該酶解條件中溫度、加酶量和反應(yīng)時(shí)間是影響酶解效果的重要因素，這與前人的研究結(jié)果相似［5，6］．利用該條件中試生產(chǎn)時(shí)能很好的水解雞骨渣，殘?jiān)枯^低，且總氮回收率在70%以上，目前該條件大部分企業(yè)基本上都能達(dá)到．因此，利用木瓜蛋白酶水解雞骨渣，為其深度開發(fā)和綜合利用提供有效途徑和技術(shù)支撐，從而提高雞骨渣的附加值．

表6 響應(yīng)優(yōu)化值與真實(shí)值之間的關(guān)系Table 6 The relation between predicted response values and practiced values

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶酶解雞骨渣最適工藝條件:溫度為65℃，加酶量在0．1%，反應(yīng)時(shí)間 1．8 h，自然 pH和1:1的料液比，有最低的殘?jiān)?4．6%、水解度在14．68%，總氮回收率為71．68%，可用于其深度開發(fā)和綜合利用．

［1］ ARIHARA K，OHATA M．Bioactive compounds in meat［M］//TOLDRA F．Meat biotechnology．New York:Springer，2008:231 －249．

［2］ NIKOLAEV I V，STEPANOVA E V，EREMEEV N L，et al．Optimization of enzymatic hydrolysis of animal raw material for obtaining functional meat protein preparation［J］．Biotechnology．2008，5:59 －67．

［3］ ADLER-NISSEN J．Limited enzymatic degradation of proteins:a now approach in the industrial application of hydrolases［J］．Journal of Chemical Technology ＆ Biotechnology，1982，32:138－156．

［4］ NITSAWANG S，HHTTI-KAUL R，KANASAWUD P．Purification of papain from Carica papaya latex:aqueous twophase extraction versus two-step salt precipitation［J］．Enzyme Microbiogy of Technology．2006，39:1103 －1107．

［5］ DAMRONGSAKKUL S，RATANATHAMMAPAN K，KOMOLPIS K，et al．Enzymatic hydrolysis of rawhide using papain and neutrase［J］．Journal of Industrial and Engineering Chemistry，2008，14(2):202 －206．

［6］ LIU J H，TIAN Y G，WANG Y，et al．Characterization and in vitro antioxidation of papain hydrolysate from black-bone silky fowl(Gallus gallus domesticus Brisson)muscle and its fractions［J］．Food Research International，2011，44:133 －138．

［7］ LIASET B，JULSHAMN K，ESPE M．Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymic hydrolysis of salmon frames with Protamex［J］．Process Biochemistry，2003，38(12):1747－1759．

［8］ POPOV V O，DOSSENA A，NIKOLAEV I V，et al．Biocatalytic approach for poultry meat＆bone residues conversion［J］．Journal of Biotechnology，2010，150，Supplement 1:570．

［9］ 吳楓楠．堿－酶法提取硫酸軟骨素的工藝研究［J］．食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，29(1):81－83．

［10］ 趙培城，高紅林，朱順達(dá)．豬硫酸軟骨素提取工藝研究［J］．食品科學(xué)，2004，25(4):14－17．

［11］ LINDER M，F(xiàn)ANNI J，PARMENTIER M．Functional properties of veal bone hydrolysates［J］．Journal of Food Science，1996，61(4):712－716．

［12］ KIM S K，BYUN H G，PARK P J，et al．Angiotensin I converting enzyme inhibitory peptide purified from bovine skin gelatin hydrolysate［J］．Journal of Agriculture of Food Chemistry，2001，49:2992 －2997．

［13］ 李少華，趙駐軍，菅景穎，等．木瓜蛋白酶水解豬皮制備膠原多肽的研究［J］．食品科學(xué)，2008，29(5):195－199．

［14］ BACK H H，CADWALLADER K R．Enzymatic hydrolysis of crayfish processing by-products［J］．Journal of Food Science，1995，5:929 －935．

［15］ ADLER-NISSEN J．Enzymatic hydrolysis of food proteins［M］．London:Elsevier Applied Science Publishers，1986．