張長明 顧耀東 符 丹 陽貴林 何立群 邵命海

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200071)

活血化瘀通絡(luò)方對5/6腎切除大鼠腎功能及腎組織p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的干預(yù)作用※

張長明 顧耀東 符 丹 陽貴林 何立群△邵命海1

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 200071)

目的從p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑觀察5/6腎切除大鼠腎組織中P38 MAPK表達(dá)及α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)改變，以初步探討活血化瘀通絡(luò)方(抗纖靈方)延緩腎纖維化的作用機(jī)制。方法將40只SD大鼠中10只為正常組，30只行5/6腎切除，造模成功后隨機(jī)分為模型組、抗纖靈組、氯沙坦組，各10只，各組干預(yù)12周后檢測各組腎功能(血清尿素氮、肌酐)以及Western Blot檢測腎組織CollagenⅠ、p38MAPK、α－SMA。結(jié)果干預(yù)12周后抗纖靈組、氯沙坦組較模型組肌酐、尿素氮有所下降，抗纖靈組、氯沙坦組p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ的分子表達(dá)較模型組明顯減輕(P＜0.05)，抗纖靈組較氯沙坦組p38MAPK、CollagenⅠ分子表達(dá)減少(P＜0.05)。結(jié)論抗纖靈方可明顯改善5/6腎切除大鼠的腎功能，可能通過抑制p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少α－SMA、CollagenⅠ的表達(dá)，減輕腎組織的損害。

p38絲裂原活化蛋白激酶類;生物合成;疾病模型，動(dòng)物;腎疾病;中藥療法

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至腎衰竭的共同病理過程，其發(fā)病機(jī)制迄今為止仍未得到完全闡明。通常認(rèn)為是多因素綜合作用的結(jié)果，涉及細(xì)胞外基質(zhì)合成增多及降解減少、促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)、單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤，氧自由基生成過多、清除減少及腎間質(zhì)細(xì)胞凋亡等方面，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與多種病理過程［1］。中藥抗纖靈組方在治療慢性腎衰竭方面療效顯著，既往研究可以抑制腎間質(zhì)纖維化，抗氧自由基，改善腎血流動(dòng)力學(xué)等［2］。本研究通過對5/6腎切除大鼠腎組織中的p38MAPK分子表達(dá)及抗纖靈沖劑的干預(yù)，以期闡明活血化瘀通絡(luò)中藥治療慢性腎衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康SPF級雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量(180±20)g，由上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號:SYXK(滬)2004－0005，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，12 h光照，45%左右相對濕度的飼養(yǎng)籠中，自由飲食。

1.2 藥物與試劑 抗纖靈藥物組成:丹參15 g，制大黃15 g，桃仁12 g，當(dāng)歸12 g，牛膝9 g。大鼠按照成人20倍服用劑量，制作水提濃縮液，含生藥2 g/mL，每次灌胃2 mL。氯沙坦(50 mg/片，杭州默沙東制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20100972)。

1.3 動(dòng)物模型制作、分組及給藥 大鼠購買后飼養(yǎng)1周，隨機(jī)取10只為正常組，不做處理，直接分籠飼養(yǎng)。其余為造模組，3%戊巴比妥鈉按1.8 mL/kg劑量腹腔注射麻醉。大鼠俯臥暴露左腎區(qū)。備皮后，從距左脊肋骨1.5 cm處做斜向外方切口，經(jīng)后腹膜取腎，暴露腎臟，剝離腎周脂肪及包膜后，弧型切除2/3腎組織(主要切除皮質(zhì)部分)約0.4 g。明膠海綿壓迫止血，切面無活動(dòng)性出血后，復(fù)位剩余左腎并縫合。7 d后相同方法麻醉大鼠，完全游離右側(cè)腎蒂后結(jié)扎，行右腎完全結(jié)扎術(shù)。2次手術(shù)相當(dāng)于切除腎臟約80%。將造模組大鼠按上述方法制作慢性腎衰竭動(dòng)物模型。10 d后動(dòng)物模型制備成功后，再隨機(jī)將造模組分為模型組10只、抗纖靈組10只、氯沙坦組10只。正常組、模型組均予以0.9%氯化鈉注射液2 mL/d灌胃?？估w靈組予抗纖靈煎液2 mL/d灌胃，氯沙坦組予氯沙坦水溶液2 mL/d，每mL含抗纖靈或氯沙坦的劑量相當(dāng)于30 kg體質(zhì)量成人每日臨床用量的10倍。

1.4 觀察指標(biāo)及方法 藥物干預(yù)12周后全部處死，心臟取血液5 mL，分離血清后常規(guī)檢測腎功能(尿素氮、肌酐)，腎臟組織:取腎皮質(zhì)分為2份，一份用10%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水、包埋，切成2 μm厚石蠟片做蘇木伊紅(HE)染色，觀察腎組織病理改變。一份腎組織于液氮中速凍后－80℃冰箱保存。

Western Blot檢測方法。蛋白樣品制備:先進(jìn)行蛋白抽提，BCA法測蛋白濃度，在562 nm左右測光吸收度，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白樣品濃度，調(diào)整蛋白樣品濃度至1 g/L。取30 g蛋白樣品與1/4體積樣品緩沖液混勻，95℃，5 min。配膠，上樣(1.5 mm，10 well，37.5L)，電泳，80 V恒壓30 min后，換120 V恒壓。當(dāng)溴酚藍(lán)前沿遷移至凝膠底部時(shí)，停止電泳。轉(zhuǎn)膜:配制轉(zhuǎn)膜緩沖液，4℃預(yù)冷。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中浸潤5～10 min，用水漂洗，再放入轉(zhuǎn)膜液中。轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓為10 V，50 min。轉(zhuǎn)膜后，將膜放置于封閉液中，TBS緩沖液(Tris緩沖鹽溶液)+0.05%Tween－20即TBST;封閉液:5%牛血清白蛋白溶于TBST中，室溫下?lián)u床振蕩1h。封閉后，用TBST洗膜3次，5 min/次。用抗體稀釋液稀釋一抗，檢測所需的一抗:CollagenⅠ、α－平滑肌肌動(dòng)蛋白(α－SMA)購自Abcam(香港)有限公司;p38MAPK購自Cell Signaling Technology公司。批號:CollagenⅠab90395;α－SMA ab7817，p38MAPK，#9212。將膜浸泡于一抗反應(yīng)液中，4℃過夜。過夜后，將膜置于室溫復(fù)溫30 min～1 h。洗膜:室溫下，用TBST漂洗膜，4次，5 min/次。孵育二抗:用TBST稀釋二抗，Goat Anti－ Mouse和 Goat Anti－ Rabbit，1∶5000。室溫避光孵育15 min，然后用TBST沖洗5 min，在近紅外雙色激光成像儀器中進(jìn)行掃描，最后將得到的圖片進(jìn)行灰度值分析，甘油醛－3－磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參。計(jì)算各組灰度值與GAPDH的比值進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(ANOVA)，多組之間的兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組12周時(shí)血清尿素氮、肌酐檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組12周時(shí)血清尿素氮、肌酐檢測結(jié)果±s

表1 各組12周時(shí)血清尿素氮、肌酐檢測結(jié)果±s

與模型組比較，*P ＜0.05;與抗纖靈組比較，△P ＜0.05

組 別 n 尿素氮(nmol/L) 肌酐(μmol/L)正常組10 5.630 ±0.365 30.400 ±2.757模型組 10 8.620 ±0.658 60.900 ±10.060抗纖靈組 10 7.167 ±0.686* 44.333 ±21.325*氯沙坦組 10 7.970±0.914＊△ 48.900±5.343＊△

由表1可見，12周時(shí)抗纖靈組、氯沙坦組血清尿素氮、肌酐低于模型組(P＜0.05)，而抗纖靈組降低血清尿素氮、肌酐優(yōu)于氯沙坦組(P＜0.05)。

2.2 各組12周時(shí)腎皮質(zhì)p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相對表達(dá)含量比較 見表2。

表2 各組12周時(shí)腎皮質(zhì)p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相對表達(dá)含量比較±s

表2 各組12周時(shí)腎皮質(zhì)p38MAPK、α－SMA、CollagenⅠ蛋白相對表達(dá)含量比較±s

與模型組比較，*P ＜0.05;與抗纖靈組比較，△P ＜0.05

組 別 p38MAPK/GAPDH α－SMA/GAPDH CollagenⅠ/GAPDH正常組0.720 ±0.093 0.647 ±0.030 0.771 ±0.071模型組 1.387 ±0.061 0.951 ±0.040 1.683 ±0.171抗纖靈組 0.902 ±0.141* 0.779 ±0.063* 0.840 ±0.181*氯沙坦組 1.050 ±0.100＊△ 0.687 ±0.067* 0.996 ±0.006＊△

由表2可見，3種蛋白相對表達(dá)檢測抗纖靈組、氯沙坦組與模型組相比均有所降低(P＜0.05)，p38MAPK、CollagenⅠ氯沙坦組高于抗纖靈組(P＜0.05)。α－SMA氯沙坦組與抗纖靈組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但均明顯低于模型組(P＜0.05)。

3 討論

引起慢性腎衰竭的原因有很多，本實(shí)驗(yàn)選擇5/6腎切除模型進(jìn)行研究，由于有效腎單位被大部分切除，殘余腎臟通過代償，引起腎系膜細(xì)胞、毛細(xì)血管等大量增生，腎通透性增加。健存腎單位代償性高濾過，導(dǎo)致腎小球的進(jìn)一步硬化，進(jìn)而引起腎小管間質(zhì)損傷。殘余腎單位發(fā)生血流動(dòng)力學(xué)改變，腎臟出現(xiàn)高灌注、高濾過、高跨膜壓(即所謂“三高學(xué)說”)，導(dǎo)致殘余腎代償性肥大、增生、硬化，最終表現(xiàn)為進(jìn)行性腎小球、腎小管功能減退，后期進(jìn)展為終末期腎病。

腎間質(zhì)纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix，ECM)的不斷積聚和α－SMA陽性的肌纖維母細(xì)胞的不斷新生、活化為特征的過程。細(xì)胞外基質(zhì)中主要成分就是Ⅰ型、Ⅲ型膠原等，腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至腎衰竭的共同病理過程［3］。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是聯(lián)系細(xì)胞膜受體與細(xì)胞內(nèi)重要的酶類，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起重要作用，它能將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)到細(xì)胞及其核內(nèi)，引起細(xì)胞一系列生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)［4］。p38MAPK信號通路作為MAPK家族的主要成員，通過對細(xì)胞內(nèi)信號的傳遞參與細(xì)胞對外界許多刺激的調(diào)節(jié)反應(yīng)。通過非磷酸化轉(zhuǎn)化為磷酸化狀態(tài)來促進(jìn)下游底物的磷酸化，快速實(shí)現(xiàn)信號傳遞。腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌纖維母細(xì)胞并在腎間質(zhì)中聚集、細(xì)胞外基質(zhì)合成增多及降解減少、腎間質(zhì)細(xì)胞凋亡等導(dǎo)致腎纖維化發(fā)生［5］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢性腎衰竭的病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾腎虧虛為主，標(biāo)實(shí)多為濕濁、熱毒、水氣、動(dòng)風(fēng)，而瘀血貫穿于慢性腎衰竭的始終。中醫(yī)的“瘀”范圍廣泛，病理方面表現(xiàn)為腎小球硬化、球囊粘連，小管間質(zhì)纖維化和萎縮，腎小球內(nèi)微血栓，系膜外基質(zhì)增多，基底膜增厚，毛細(xì)血管腔塌陷或狹窄，血管襻擠壓、閉塞等改變。

抗纖靈多年來一直用于臨床和科研，方中當(dāng)歸、丹參、桃仁養(yǎng)血活血通絡(luò)，制大黃活血降濁通便，牛膝補(bǔ)腎強(qiáng)腰膝，合方以活血化瘀通絡(luò)為主。既往結(jié)果表明本方可能通過降低大鼠腎組織NF－κB及ATⅡ、ATⅡ受體mRNA表達(dá)，延緩腎纖維化進(jìn)展，進(jìn)而保護(hù)殘余腎單位的功能［6］。

血管緊張素受體拮抗劑(ARB)，不僅可以降低腎性高血壓，還有一定的腎臟保護(hù)作用。其作用機(jī)制獨(dú)立于降壓之外，可以激活或抑制一些細(xì)胞因子或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而起到腎臟保護(hù)有關(guān)［7］。氯沙坦(losartan)為非肽類高選擇性血管緊張素Ⅱ－1型受體(AT1)阻滯劑，可拮抗AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)增高，提示ARB類藥物可以通過下調(diào)足細(xì)胞VEGF的表達(dá)水平，而減少蛋白尿的發(fā)生，發(fā)揮保護(hù)腎臟作用［8］。

本研究結(jié)果表明氯沙坦、抗纖靈均可以降低5/6腎切除大鼠血清尿素氮、肌酐，延緩腎臟功能惡化。改善腎功能抗纖靈組優(yōu)于氯沙坦組，5/6腎切除術(shù)可能觸發(fā)p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)p38MAPK表達(dá)增加，進(jìn)一步啟動(dòng)促纖維化因子—α－SMA而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)CollagenⅠ的合成，導(dǎo)致了腎纖維化的發(fā)生?？估w靈方可能是通過抑制p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少α－SMA、Ⅰ型膠原的表達(dá)，通過改善血流動(dòng)力學(xué)等以減輕腎組織的損害。

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Intervention effect of prescription with promoting blood flow，dispersing blood stasis and dredge collateral on renal tissue p38MAPK signal transduction pathway in rats with 5/6 kidney resection

ZHANG Changming，GU Yaodong，F(xiàn)U Dan，et al.Department of Nephrology，Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai200071

ObjectiveTo observe signaling molecules protein expression in the renal tissue and changes of a－SMA(a－smooth muscle actin)and Collagen I(type I collagen)by p38MAPK signal transduction pathway，and explore the mechanism of prescription with promoting blood flow，dispersing blood stasis and dredge collateral(Kangxianling prescription)for delaying renal fibrosis.Methods30 of 40 SD rats were made 5/6 kidney resection model，10 rats was as a normal group.30 rats with 5/6 kidney resection were randomly divided into model group，Kangxianling prescription group Losartan group.The levels of creatinine and urea nitrogen and molecules expression of p38MAPK，a－SMA and Collagen I were measured after intervention of 12 weeks.ResultsThe levels of creatinine and urea nitrogen in Kangxianling prescription group and Losartan group were decreased compared with those in the model group after 12 weeks.Molecules expression of p38MAPK，a－SMA and Collagen I in Kangxianling prescription group and Losartan group were decreased compared with those in the model group(P＜0.05).The expression of p38 MAPK and Collagen I in Kangxianling prescription group were decreased as compared with those in Losartan group(P＜0.05).ConclusionKangxianling prescription can significantly improve renal function of rat with 5/6 kidney resection，by inhibition of p38MAPK signal transduction pathways，to reduce the expression of a－SMA，I collagen，and mitigate the damage of kidney tissue.

p38 mitogen－activated protein kinase;Biosynthesis;Disease model;Animal;Renal disease;Traditional Chinese medicine therapy

R－332;R345.57;R692.053.1;R692.5

A

1002－2619(2012)11－1704－03

※項(xiàng)目來源:上海市衛(wèi)生局科研課題(編號:2010220);國家自然基金(編號:81173219);科技部中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(編號:201007005);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目(編號:20093107110006);上海市科委創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(編號:11DZ1973100);上海市教育委員會(huì)E－研究院建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目(編號:E03008);上海高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(編號:201203)

△通訊作者:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎內(nèi)科，上海201203

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腎內(nèi)科，上海 201203

張長明(1970—)，男，副主任醫(yī)師，博士，碩士研究生導(dǎo)師。從事慢性腎衰竭的中西醫(yī)結(jié)合研究。

2012－07－16)