曹敏，王麗，劉海朝，潘贊紅，劉建衛(wèi)，邊育紅

（1．天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津市第二人民醫(yī)院，天津 300192）

肝臟是調節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)的重要器官，可以去除機體許多有害化學物質和藥物，基于這些重要功能，肝臟也易被這些物質損傷[1]。研究表明，抗氧化防御系統(tǒng)紊亂是肝損傷的主要機制之一[2]?？寡趸瘎┑膽靡脖徽J為是防治氧化應激性肝病的一種合理治療策略[3]。核因子相關因子2（Nrf2）是細胞氧化還原的主要調節(jié)因子，在肝臟、腎臟中表達較高[4]。經證實，活化后入核的Nrf2與抗氧化和解毒基因啟動子區(qū)域的的抗氧化反應元件（AREs）結合進而激活下游血紅素氧合酶1（HO-1）、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（Gclc）和醌氧化還原酶 1（NQO1）等Ⅱ相解毒酶或抗氧化基因的表達[5]。因此，激活Nrf2及其相關抗氧化酶可能在治療慢性肝損傷中發(fā)揮重要作用。

抗纖丸是天津市第二人民醫(yī)院劉作恩醫(yī)師在多年臨床實踐中總結出的經驗方。該方以“血府逐瘀湯”為底方，加入冬蟲夏草、黃芪等補益藥研制而成，具有扶正祛邪、活血化瘀的功效。臨床上用于治療肝損傷，肝纖維化等慢性肝病，療效顯著，但其具體作用機制尚未明確。研究表明，抗纖丸組方中當歸[6]、川芎[7]和冬蟲夏草[8]等中藥均具有抑制氧化應激的作用。當歸多糖通過抑制氧化應激并減少肝細胞凋亡緩解對乙酰氨基酚誘導的肝細胞損傷[9]。五味子醇提物主要活性成分之一的五味子酸性多糖通過降低丙二醛（MDA）水平，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性改善乙醇誘導的氧化損傷[10]。此外，前期的研究表明抗纖丸通過調節(jié)腸道菌群，抑制腸上皮的通透性，減輕肝臟的炎癥反應緩解四氯化碳（CCL4）誘導的慢性肝損傷[11]。為了探討抗纖丸治療慢性肝損傷的潛在機制，本文通過腹腔注射CCL4建立慢性肝損傷小鼠模型，基于Nrf2信號通路，初步探討抗纖丸對模型小鼠肝細胞損傷的保護作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 抗纖丸由天津市第二人民醫(yī)院提供；甘草酸二銨腸溶膠囊購自正大天晴藥業(yè)集團；四氯化碳（CCL4，純度≥99%）購自天津市凱通化學試劑有限公司；天冬氨酸轉氨酶（AST）檢測試劑盒（貨號：C010-1-1）；丙氨酸轉氨酶（ALT）試劑盒（貨號：C009-1-1）；Masson三色染色液試劑盒（貨號：G1340），DAB 顯色試劑盒（貨號：DA1010）購自北京索萊寶科技有限公司；山羊抗鼠IgG（貨號：bs-0296GBio）購自北京博奧森生物技術有限公司；抗α-SMA抗體（貨號：ab7817）購自Abcam公司，抗-Nrf2抗體（貨號：16396-1-AP），抗-HO-1抗體（貨號：10701-1-AP），抗-NQO1 抗體（貨號：67240-1-lg），抗-Gclc抗體（貨號：12601-1-AP）和抗-β-actin抗體（貨號：20536-1-AP）都購自Proteintech公司；總蛋白定量測試盒（貨號：A045-4-2）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號：A001-1-2）；丙二醛（MDA）測試盒（貨號：A003-1-2）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（貨號：A005-1-2）均購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒（貨號：DP419）、反轉錄試劑盒（貨號：KR116）、熒光定量擴增試劑盒（貨號：FP205）均購自天根生物科技有限公司。

1.2 實驗分組及模型復制

1.2.1 實驗分組 雄性BALB/c小鼠40只，6周齡，體質量（20±2）g，購自斯貝福生物技術有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2019-0010。適應性喂養(yǎng)一周后，采用隨機數字表法分為正常組、模型組，甘草酸二銨組（陽性對照組）、抗纖丸組，每組10只。

1.2.2 動物模型復制 正常組：腹腔注射橄欖油溶液（2 mL/kg），每周2次，連續(xù)6周；模型組、陽性對照組、抗纖丸組：腹腔注射20%的CCL4橄欖油溶液（2 mL/kg），每周 2 次，連續(xù) 6 周[12]。

1.3 給藥方法 持續(xù)造模6周后，每組隨機取2只，收集血清和肝組織。檢測血清中轉氨酶水平，肝組織中SOD，GSH-Px以及MDA等氧化應激的標志物。蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肝組織的病理變化，確定造模是否成功。造模成功后，將慢性肝損傷模型小鼠隨機分為模型組，甘草酸二銨組（陽性對照組）、抗纖丸組。正常組和模型組每日灌服生理鹽水10 mL/kg，陽性對照組和抗纖丸組分別灌服甘草酸二銨水溶液60 mg/（kg·d）[13]和抗纖丸水溶液3 g/（kg·d），連續(xù)灌胃4周。

1.4 指標檢測

1.4.1 小鼠的一般情況及肝指數 造模給藥期間觀察小鼠的毛色及生活狀況、隔日測量小鼠的體質量。末次給藥后小鼠禁食12 h，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉小鼠，記錄小鼠體質量后脫頸處死小鼠。取小鼠的整個肝組織于生理鹽水中清洗后用濾紙吸干水分，稱質量，按照如下公式計算小鼠的肝指數：肝指數（%）=肝質量（g）/體質量（g）×100[13]。

1.4.2 血清AST、ALT水平檢測 各組小鼠目內眥取血后，室溫靜置30 min，離心半徑8 cm，轉速3 000 r/min離心5 min，收集血清。根據說明書檢測血清中（ALT），AST的水平。

1.4.3 肝組織病理學檢測 取各組小鼠相同部位厚約5 mm的肝組織固定于4%的多聚甲醛溶液中。經石蠟包埋，切片（4 μm），H＆E 染色觀察各組小鼠肝組織的病理改變。

1.4.4 肝組織Masson染色 按說明書依次將蠟切片石脫蠟至水、蘇木素染細胞核、麗春紅染色、磷鉬酸處理、苯胺藍染色、1%冰醋酸分化后將切片依次放入95%酒精，無水乙醇，二甲苯中脫水透明后稍晾干，用中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察肝組織膠原纖維的變化。

1.4.5 肝組織α-SMA免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水，滅活內源性過氧化物酶，熱修復抗原后滴加山羊血清封閉液，滴加一抗α-平滑肌動蛋白（α-SMA，1∶300）4℃孵育過夜，PBS清洗，滴加二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明、中性樹膠封片后光學顯微鏡觀察。

1.4.6 肝組織中SOD、GSH-Px和MDA含量的檢測準確稱取各組小鼠的肝組織取100 mg，加入900 μL的生理鹽水于冰上超聲勻漿，制備成10%的肝組織勻漿。離心（3 000×g，4℃，10 min）取上清，按說明書檢測肝組織勻漿蛋白含量、SOD、GSH-Px的活性和MDA的含量。

1.4.7 肝組織Nrf2、HO-1及相關基因的表達 取各組小鼠的肝組織，提取肝組織中的總RNA，反轉錄合成cDNA，采用SYBR Green Real-time PCR試劑盒擴增，以相對定量法檢測小鼠肝臟組織中Nrf2，HO-1、Gclc和 NQO1的 mRNA 表達水平，采用GAPDH做內參，見表1。運用2-ΔΔCT方法計算對照組和給藥組的mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

1.4.8 肝組織Nrf2、HO-1及相關蛋白的表達 取小鼠肝臟組織30 mg加入裂解液500 mL（RIPA∶PMSF=100∶1），勻漿離心后取上清，使用 BCA 蛋白測定試劑盒測定總蛋白濃度。制備8%的SDSPAGE分離膠，取等量蛋白（20 μg）電泳后將分離的蛋白轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2小時后，分別加入抗 Nrf2（稀釋比例 1∶1000）、抗 HO-1（稀釋比例 1∶2 000）、抗 Gclc（稀釋比例 1∶6 000）、抗NQO1（稀釋比例 1∶10 000）、抗 β-actin（稀釋比例 1∶2 000）。4℃孵育過夜后加入二抗羊抗兔IgG（稀釋比例1∶10 000），室溫孵育1 h。TBST洗膜后使用ECL試劑，顯影成像。使用image J對條帶進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計分析數據，GraphPad Prism 7繪制統(tǒng)計分析圖。所有計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗纖丸對慢性肝損傷模型小鼠治療作用的影響 本研究通過檢測血清AST和ALT的水平，計算肝指數以及觀察肝組織的病理改變考察抗纖丸對CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠的治療作用。與正常組相比，模型組小鼠肝指數明顯升高（P<0.01）；與模型組相比，陽性對照組與抗纖丸組的肝指數明顯降低（P<0.01），見表2。與正常組相比，模型組小鼠AST與ALT活性均顯著增加（P<0.01）；與模型組相比，陽性對照組與抗纖丸組血清中轉氨酶活性明顯降低（P<0.01），見表2。HE染色結果顯示，正常組小鼠肝小葉結構正常，肝細胞呈條索狀分布，肝細胞結構清晰；與正常組相比，模型組肝小葉結構紊亂，肝細胞廣泛水腫并伴有壞死，而陽性對照組與抗纖丸組能顯著的改善CCL4所致的肝組織病變，見圖1A。Masson染色結果顯示，模型組膠原沉積明顯增多，而陽性對照組與抗纖丸組膠原沉積的程度均有不同程度的改善，見圖1B，2A。免疫組化的結果顯示，與正常組相比，模型組α-SMA的表達明顯增加；與模型組相比，陽性對照組與抗纖丸組α-SMA的表達明顯降低，見圖1C，2B。這些結果說明，抗纖丸能明顯改善CCL4誘導的肝組織損傷，并且通過減少小鼠肝組織中膠原積累，降低α-SMA的表達明顯抑制了CCl4誘導肝損傷向肝纖維化進展的趨勢。

表2 抗纖丸對慢性肝損傷小鼠轉氨酶及肝指數的影響（±s）

表2 抗纖丸對慢性肝損傷小鼠轉氨酶及肝指數的影響（±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

組別 例數正常組 8模型組 8陽性對照組 8抗纖丸組 8 AST（U/L） ALT（U/L） 肝指數（%）35.66± 4.74 17.64± 3.7 4.55±0.16 113.79±20.67## 99.45±11.33## 6.31±0.43##38.07± 6.32**34.18±11.95** 5.38±0.35**50.47±14.51**37.86± 8.85** 5.43±0.17**

圖1 小鼠肝組織H＆E染色，Masson染色和α-SMA的表達

2.2 抗纖丸對慢性肝損傷模型小鼠氧化損傷的影響 研究表明，過氧化/抗氧化系統(tǒng)與肝損傷的病理過程密切相關[14]。因此，本研究通過檢測肝組織中SOD和GSH-Px的活性以及MDA的含量考察抗纖丸對CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠氧化損傷的影響。與正常組相比，模型組小鼠肝組織中SOD，GSH-Px活性明顯降低（P<0.01），同時MDA的含量增加（P<0.01）；與模型組相比，給予甘草酸二銨和抗纖丸水溶液灌胃治療后肝組織中SOD，GSH-Px活性增加（P<0.05），MDA的含量也顯著降低（P<0.01），見圖3。這說明，抗纖丸能抑制氧化應激緩解CCL4誘導的慢性肝損傷。

圖2 各組小鼠肝組織中Masson染色和α-SMA免疫組化的分析

圖3 抗纖丸對各組小鼠肝組織中SOD，GSH-Px和MDA含量的影響

2.3 抗纖丸對慢性肝損傷模型小鼠肝組織中Nrf2相關基因及蛋白表達的影響 Nrf2相關通路被認為是細胞抗氧化應激最重要的機制[15]。為了驗證抗纖丸是否通過激活Nrf2信號通路保護肝細胞氧化損傷，檢測了肝組織中Nrf2通路相關基因和蛋白的表達水平。與正常組相比，慢性肝損傷模型組小鼠肝組織中Nrf2，HO-1，NQO1和Gclc的mRNA表達水平均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組小鼠肝組織中Nrf2，HO-1，NQO1和Gclc和抗纖丸組小鼠肝組織中Nrf2，HO-1，NQO1和Gclc的mRNA表達水平均顯著上調（P＜0.05或P＜0.01），見圖4。此外，WB的結果顯示與正常組相比，慢性肝損傷模型組小鼠肝組織中Nrf2，NQO1和Gclc的蛋白表達水平均顯著下調（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組相比，陽性藥對照組小鼠肝組織中Gclc和抗纖丸組小鼠肝組織中Nrf2，NQO1和Gclc的蛋白表達水平均顯著上調（P＜0.05 或 P＜0.01），見圖5。這些結果說明抗纖丸能激活Nrf2及下游相關抗氧化酶，從而緩解CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠肝細胞氧化應激水平。

圖4 抗纖丸對各組小鼠Nrf2通路相關基因表達的影響

圖5 抗纖丸對各組小鼠Nrf2通路相關蛋白表達的影響

3 討論與結論

CCL4被廣泛用于制備小鼠肝損傷模型。研究表明，CCL4可通過細胞色素P450酶代謝產生三氯甲烷自由基（·CCl3）或三氯甲烷過氧化物（·OOCCl3）自由基，誘導肝細胞氧化損傷[16]。本實驗采用CCL4腹腔注射6周后，檢測血清中AST，和ALT的水平均顯著增高；此外，病理切片顯示肝組織結構紊亂，肝細胞水腫且伴有壞死。這與前期報道的結果一致，說明模型復制成功[17]。

ALT、AST被認為是肝組織損傷的敏感指標[2]，研究結果表明，抗纖丸能顯著降低CCL4誘導的慢性肝損傷模型小鼠血清中轉氨酶活性的升高。此外，HE染色結果也顯示抗纖丸能顯著抑制肝細胞損傷。研究表明，在慢性肝損傷過程中，細胞外基質（ECM）的合成與降解的平衡被破壞，導致肝ECM產生過多[18]。膠原是ECM的主要成分，正如Masson染色的結果顯示抗纖丸能顯著減少慢性肝損傷小鼠肝組織的膠原沉積。α-SMA是肌成纖維細胞活化的標志，在纖維形成過程中起關鍵作用[19]。免疫組化的結果顯示，抗纖丸能顯著減少α-SMA的表達，這說明抗纖丸能延緩慢性肝損傷進一步向肝纖維化進展。

研究表明，氧化應激在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。MDA是脂質過氧化的最終產物，可間接反映自由基對肝臟的損傷程度。相反，SOD和GSH-Px可保護肝細胞免受氧化劑的傷害，清除脂質過氧化物和氧自由基[20]。與預期的結果一致，抗纖丸組能明顯逆轉SOD，GSH-Px和MDA等氧化損傷相關參數的變化。Nrf2作為細胞氧化還原的主要調節(jié)因子，在抑制氧化應激緩解肝損傷的中起關鍵作用[21]。經證實，肝臟中特異性敲除Nrf2的基因小鼠比野生型小鼠更易誘發(fā)氧化應激導致肝損傷[22]，而使用Nrf2激活劑可以緩解氧化損傷引發(fā)的疾病[23]。在生理條件下，Nrf2與Kelch樣ECH相關蛋白1（Keap1）結合位于細胞質中，而在氧化或親電應激時，Nrf2與Keap1解離并轉位進入細胞核與sMaf蛋白等形成二聚體與抗氧化和解毒基因啟動子區(qū)域的AREs結合激活下游II相解毒酶和抗氧化基因發(fā)揮抗氧化作用[5，24]。結果顯示，抗纖丸組能明顯激活慢性肝損傷模型小鼠肝組織中Nrf2、HO-1、NQO1和Gclc的mRNA表達水平，以及肝組織中Nrf2、NQO1和Gclc的蛋白表達水平。

本研究結果表明抗纖丸能增加肝組織中SOD、GSH-Px的水平并且激活肝組織中 Nrf2、HO-1、NQO1和Gclc等抗氧化酶活性，提示抗纖丸可能是通過抑制氧化應激保護肝細胞受損，這為抗纖丸的臨床應用提供了基礎理論依據。此外，本研究選用甘草酸二銨作為陽性藥，結果顯示抗纖丸對CCL4誘導的慢性肝損傷小鼠相關療效指標與甘草酸二銨處理組無顯著差異，但是抗纖丸在臨床中能否替代甘草酸二銨還有待進一步研究。