楊云秀，胡孫寬，葉星照，白永恒，王斯璐，劉 彪，王本泉，陳必成，陳宗靜

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院1.肝膽胰外科;2.消化內(nèi)科;3.外科實驗室，浙江 溫州 325000)

胰腺癌的臨床治療效果一直不理想，臨床常用的化療藥物不能顯著延長胰腺癌患者的生存率，其5年生存率僅為3%。近年研究顯示，影響表觀遺傳的化學藥物具有抗腫瘤作用，除DNA甲基化外，組蛋白乙?；彩潜碛^遺傳修飾的重要內(nèi)容［1］。組蛋白去乙?；?(histone deacetylase，HDAC)催化的乙?；磻谡婧嘶虻谋磉_調(diào)控中起重要作用，可通過對核心組蛋白的可逆修飾來調(diào)節(jié)組蛋白的乙酰化水平，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄的起始和延伸。HDAC抑制劑能夠抑制HDAC的活性，改變組蛋白和非組蛋白的乙?；?，從而可以選擇性地調(diào)控部分腫瘤相關基因［2］。研究表明，HDAC抑制劑可通過改變組蛋白的乙?；癄顟B(tài)調(diào)控腫瘤相關基因的表達、阻礙細胞周期、抑制腫瘤血管生成以及改變熱激蛋白90的乙?；癄顟B(tài)等機制［3-6］，在體外誘導多種腫瘤細胞的生長停滯、分化或凋亡。曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是一種得到廣泛關注的HDAC抑制劑，本研究主要通過TSA體外處理胰腺癌細胞，檢測腫瘤增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的相關基因表達，探討TSA誘導胰腺癌PANC-1細胞凋亡機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

TSA購自Sigma公司(美國)，用二甲亞砜(DMSO，Sigma)溶解至 10 μmol·L-1，使用前用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trizol購自Gibco BRL公司，Hoechst 33258購自Sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreenⅠ熒光定量試劑盒購自東洋紡(上海)生物科技有限公司，熒光PCR所用引物由周蒙滔教授饋贈(引物序列見表1)。Notch受體胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain，NICD)兔抗人一抗以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗購于Abcam生物公司。胱天蛋白酶3活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。酶標儀為ELX800(Bio-Tek)產(chǎn)品，熒光 PCR儀為 ABI7500(ABI)。

Tab.1 Sequence of primers used with real-time PCR

1.2 細胞培養(yǎng)

PANC-1培養(yǎng)在含10%胎牛血清、鏈霉素100 g·L-1、青霉素100 g·L-1的 DMEM 培養(yǎng)液里，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞處理后分組，TAS組加入 TAS 0.1，0.2，0.4 和0.6 μmol·L-1，正常對照組加入等量的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測細胞存活

取對數(shù)生長期PANC-1細胞，用0.25%的胰酶消化，收集并調(diào)整細胞密度為5×107L-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μl，待細胞貼壁后棄去培養(yǎng)基，分別加入100 μl終濃度為 0.1，0.2，0.4 和0.6 μmol·L-1的 TSA，分別作用 0，12，24 和 48 h，正常對照組不加TSA，同時設置空白調(diào)零組〔不加細胞僅加入等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)〕。培養(yǎng)結束前4 h 每孔加入 20 μl MTT(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min左右，使結晶充分溶解后，立即于酶標儀490 nm處測定吸光度值(absorbance，A490nm)。計算腫瘤細胞增殖抑制率(inhibitory rate，IR)，IR(%)=1-(實驗組A490nm-空白組A490nm)/(正常對照組A490nm-空白組A490nm)×100%。每個濃度設6個平行孔。

1.4 Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞凋亡

TSA 0.4 μmol·L-1處理0，12，24，48 h 后，移去培養(yǎng)基，用冷PBS洗2次，4%甲醛液固定10 min，棄固定液，雙蒸水沖洗2次，Hoechst 33258(5 mg·L-1)避光染色5 min，然后用雙蒸水沖洗2次，室溫下涼干后于熒光(激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm)顯微鏡下觀察，并隨機選取位置進行拍照。

1.5 胱天蛋白酶3活性的測定

將PANC-1細胞接種在 12孔板后，TSA 0.4 μmol·L-1處理細胞 0，4，8 和 12 h 后，按照胱天蛋白酶3活性測定試劑盒操作說明進行。實驗重復3次，結果取平均值。

1.6 實時定量PCR方法檢測靶基因表達

取 TSA 0.4 μmol·L-1處理 24 h 和正常對照組細胞，用Trizol試劑盒提取兩組細胞的總RNA，每組吸取2 μg RNA樣本在10 μl體系中進行逆轉(zhuǎn)錄反應，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μl進行 PCR 擴增，PCR 擴增體系:5 μl 2 ×SYBR Green 熒光定量試劑、2 μl引物(上、下游各 1 μl，終濃度 200 nmol·L-1)、2 μl反應緩沖液、1 μl cDNA。檢測靶基因包括:存活素、p53、c-myc、Bcl-2，Bax、金屬蛋白酶1組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase 1，MMP1)以及Notch通路關鍵分子Notch-1。擴增程序為:95℃ 10 min，95℃ 15 s，62℃ 10 s，40 個循環(huán)。得到的 Ct值用 2-△△Ct法計算mRNA表達。

1.7 細胞免疫化學檢測NICD蛋白的表達

將細胞經(jīng)胰酶消化收集后，分別以2×105個細胞接種于含載玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞至 80% ～90%融合后，分別用 TSA 0，0.4和0.6 μmol·L-1處理 24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS 清洗細胞3次，用4%多聚甲醛固定60 min。5% ～10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，在各細胞爬片上滴加一抗工作液抗NICD，37℃孵育l h，PBS沖洗3次，滴加生物素標記二抗工作液，37℃孵育30 min;PBS沖洗3次。二氨基聯(lián)苯胺顯色，細胞胞質(zhì)和胞核呈棕黃色為陽性著色，蘇木精復染后常規(guī)脫水、透明、封片。每組取3張片，每張片子取8個高倍視野(200×)，運用Image Pro Plus軟件分析NICD染色的平均吸光度值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 TSA對PANC-1細胞存活的影響

圖1結果顯示，TSA對PANC-1細胞存活有顯著的抑制作用，且抑制作用具有較好的量效(r=0.640，P=0.01)和時效(r=0.768，P=0.002)關系。作圖法求出TSA的半數(shù)抑制濃度為12 h:IC50=0.42 μmol·L-1;24 h:IC50=0.32 μmol·L-1;48 h:IC50=0.19 μmol·L-1。

Fig.1 Effect of trichostatin A(TSA)on PANC-1 cell porliferation by MTT.，n=6.

2.2 TSA誘導PANC-1細胞凋亡

TSA 0.4 μmol·L-1分別處理 0，12，24 和 48 h，Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)TSA處理的正常細胞核染色較淡(圖2A)，早期凋亡細胞核由于染色體發(fā)生皺縮而染成亮藍色容易與正常細胞區(qū)分。隨著藥物作用時間延長，細胞核亮藍色染色比例明顯增加，TSA作用48 h PANC-1細胞核染成亮藍色數(shù)目最多(圖2B，C，D)。

2.3 TSA對PANC-1細胞胱天蛋白酶3活性的影響

圖3 結果示，TSA 0.4 μmol·L-1處理0，4，8 和12 h后，PANC-1細胞內(nèi)激活的胱天蛋白酶3隨時間的增加活性增強，分別為正常對照組的(1.62±0.12)倍，(2.68 ±0.17)倍和(3.92 ±0.23)倍(F=97.8，P ＜0.01)。

Fig.3 Effect of TSA on caspase 3 activity of PANC-1 cells.PANC-1 cells were cultured with TSA 0.4 μmol·L-1for 0，4，8 and 12 h.，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with control(0 h)group.

2.4 TSA對PANC-1細胞凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因表達的影響

表4結果顯示，與正常對照組相比，TSA 0.4 μmol·L-1作用 PANC-1 細胞 24 h 后凋亡相關基因存活素，c-myc和p53 mRNA表達均明顯下降，Bax表達明顯上升，Bcl-2 mRNA未見明顯變化，但Bcl-2/Bax值降低明顯，僅為對照組的14%。腫瘤轉(zhuǎn)移相關基因MMP1和TIMP1 mRNA的表達顯著升高(F=39.2，P=0.003;F=9.5，P=0.039)。

Fig.2 Effect of TSA on PANC-1 cell apoptosis detected by Hoechst 33258 staining(× 200).A-D:TSA 0.4 μmol·L-1treated PANC-1 for 0，12，24 and 48 h，respectively.Arrows show apopotic cells.

Tab.4 Effect of TSA on apoptosis-related and metastasis-related gene expression in PCNA-1

2.5 TSA對PANC-1細胞Notch-1 mRNA及其活化分子NICD表達的影響

TSA 0.4 μmol·L-1處理 PANC-1 細胞 24 h 后，Notch-1 mRNA表達與正常對照組相比變化不明顯，無統(tǒng)計學意義(F=6.87，P＞0.05)。細胞免疫化學檢測Notch-1的活化分子NICD發(fā)現(xiàn)，正常對照組僅顯示蘇木素藍染的細胞核(圖4A)，而TSA 0.4和0.6 μmol·L-1作用24 h均有棕黃色 NICD 染色陽性細胞，并隨藥物濃度增加陽性細胞棕黃色逐漸加深(圖4B，C)。Image Pro Plus軟件定量分析結果顯示，TSA 0.4 和0.6 μmol·L-1組 NICD 蛋白的相對表達分別為 0.143 ±0.009 和 0.264 ±0.013，與正常對照組0.072 ±0.009相比有明顯差異(F=131.1，P ＜0.05)。

Fig.4 Effect of TSA on expression of Notch intracellular domain(NICD)in PANC-1 cells by immunocytochemistry(× 200).A:normal control;B:TSA 0.4 μmol·L-1for 24 h;C:TSA 0.6 μmol·L-1for 24 h.

3 討論

組蛋白乙酰化是調(diào)節(jié)基因表達的表觀遺傳修飾的一種，調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化程度主要有組蛋白乙?；负虷DAC的相互協(xié)調(diào)來完成。組蛋白乙?；蓙y可能會導致染色體結構變化，調(diào)節(jié)細胞周期、分化以及凋亡的基因轉(zhuǎn)錄水平的失調(diào)，進而影響細胞的生長導致凋亡［7］。由于大多數(shù)腫瘤細胞中都呈高度乙酰化狀態(tài)［8］，因此具有抑制HDAC的活性的化療藥物成為抗癌治療的研究熱點。TSA是一種去乙酰化酶抑制劑，能夠有效地抑制HDAC的活性，促進組蛋白和非組蛋白的乙?；揎?，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控腫瘤生長、增殖以及凋亡相關蛋白的表達和降解，活化凋亡信號通路［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，TSA可以抑制PCNA-1的生長導致其凋亡，并通過MTT法、Hoechst 33258核染色和胱天蛋白酶3的激活情況得以證實。雖然TSA并不影響Notch-1的表達，但是NICD表達增加，提示Notch通路激活。并且TSA可上調(diào)凋亡基因的表達如Bax，下調(diào)抗凋亡基因c-myc，存活素和Bcl-2 mRNA的表達。在本實驗中TSA誘導胰腺癌細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡特性，同時伴隨著凋亡相關基因的改變。

研究發(fā)現(xiàn)，TSA能通過它的氧肟酸螯合HDAC活化位點上的鋅離子而抑制Ⅰ型和Ⅱ型 HDAC的活性，達到調(diào)控基因表達的作用，從而改變腫瘤細胞內(nèi)重要的生長通路促進其凋亡［10］。目前已有文獻證明TSA可以誘導多種腫瘤細胞的凋亡，而細胞凋亡的啟動和發(fā)展受到多種蛋白酶的控制，控制凋亡的途徑主要有兩條:死亡受體途徑和線粒體途徑。線粒體途徑是細胞凋亡的經(jīng)典途徑，在凋亡的過程中胱天蛋白酶3被激活而發(fā)揮功能。實驗結果表明，胱天蛋白酶3活性隨著TSA作用時間的延長而增強，與Sato等［11］研究結果相一致，可見MTT方法檢測到的細胞增殖抑制是通過TSA誘導PANC-1細胞凋亡的結果，在這一過程中大量胱天蛋白酶3被激活;同時Hoechst 33258熒光染色也證實了大量細胞發(fā)生了凋亡。

P53可調(diào)控凋亡途徑中的多種蛋白如Bax和Apaf1，但 PANC-1 表達的可能為突變的 P53［12］，TSA下調(diào)突變p53 mRNA的表達促進其凋亡。存活素作為凋亡抑制蛋白家族之一，在正常組織中不表達，而在腫瘤組織中有較高的表達，是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，可直接作用于細胞凋亡途徑中胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶7抑制細胞凋亡，其抑制凋亡的效果遠遠大于Bcl-2家族［13］。本實驗結果表明，TSA處理細胞導致存活素mRNA表達明顯下降，可通過減除對胱天蛋白酶3的抑制而促進細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白調(diào)控細胞凋亡，其中促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。尤其是Bcl-2/Bax蛋白比率的降低被認為是凋亡過程中一個重要因素。二者在線粒體膜上形成二聚體，調(diào)控著線粒體膜的通透性。當其比值降低時，線粒體膜通透性升高，細胞色素c大量釋放，進而激活胱天蛋白酶3導致細胞凋亡。本實驗結果顯示，TSA對Bcl-2 mRNA表達無影響，但顯著升高Bax mRNA表達，導致Bcl-2/Bax mRNA比率降低。表明線粒體通路參與了TSA誘導細胞凋亡的過程。

Notch通路在腫瘤細胞生長、增殖、分化過程中起重要作用，因而成為治療腫瘤的重要靶點。但研究者對Notch通路激活影響細胞凋亡的意見卻不盡一致，Wang等［14］發(fā)現(xiàn)通過抑制腫瘤細胞Notch通路可抑制胰腺癌細胞的生長并促進腫瘤細胞的凋亡，而Greenblat等［15］則發(fā)現(xiàn)在髓質(zhì)型甲狀腺癌中，Notch 通路的激活可以誘導癌細胞發(fā)生凋亡。由此可見可能是由于腫瘤性質(zhì)不同，具體機制還需進一步研究。在本研究中，TSA并不影響Notch-1 mRNA表達，但對Notch通路有激活作用，活化分子NICD蛋白入核現(xiàn)象明顯。同樣MMP1和TIMP-1也具有一定的抗凋亡作用。在誘導凋亡的模型中，廣譜MMP1抑制劑會增加胱天蛋白酶3活性和DNA片段出現(xiàn)的時間［16］，推測MMP1具有抑制腫瘤細胞凋亡的作用。研究結果顯示，TSA使PANC-1細胞MMP1和TIMP-1 mRNA表達明顯升高，其凋亡機制可能激活Notch通路、MMP1和TIMP-1通路有關。

［1］Ballestar E，Wolffe AP.Methyl-CpG-binding proteins.Targeting specific gene repression［J］.Eur J Biochem，2001，268(1):1-6.

［2］Kim DH，Kim M，Kwon HJ.Histone deacetylase in carcinogenesis and its inhibitors as anti-cancer agents［J］.J Biochem Mol Biol，2003，36(1):110-119.

［3］Nozell S，Laver T，Patel K，Benveniste EN.Mechanism of IFN-beta-mediated inhibition of IL-8 gene expression in astroglioma cells［J］.J Immunol，2006，177(2):822-830.

［4］Kamitani H， Taniura S， Watanabe K， Sakamoto M，Watanabe T，Eling T.Histone acetylation may suppress human glioma cell proliferation when p21 WAF/Cip1 and gelsolin are induced［J］.Neuro Oncol，2002，4(2):95-101.

［5］Harper J，Yan L，Loureiro RM，Wu I，F(xiàn)ang J，D'Amore PA，et al.Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24［J］.Cancer Res，2007，67(18):8736-8741.

［6］Yu X，Guo ZS，Marcu MG，Neckers L，Nguyen DM，Chen GA，et al.Modulation of p53，ErbB1，ErbB2，and Raf-1 expression in lung cancer cells by depsipeptide FR901228［J］.J Natl Cancer Inst，2002，94(7):504-513.

［7］Hess-Stumpp H，Bracker TU，Henderson D，Politz O.MS-275，a potent orally available inhibitor of histone deacetylases-the development of an anticancer agent［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39(7-8):1388-1405.

［8］Batty N，Malouf GG，Issa JP.Histone deacetylase inhibitors as anti-neoplastic agents［J］.Cancer Lett，2009，280(2):192-200.

［9］Marks PA，Dokmanovic M.Histone deacetylase inhibitors:discovery and development as anticancer agents［J］.Expert Opin Investig Drugs，2005，14(12):1497-1511.

［10］Acharya MR，Sparreboom A，Venitz J，F(xiàn)igg WD.Rational development of histone deacetylase inhibitors as anticancer agents:a review［J］.Mol Pharmacol，2005，68(4):917-932.

［11］Sato N，Ohta T，Kitagawa H，Kayahara M，Ninomiya I，F(xiàn)ushida S，et al.FR901228，a novel histone deacetylase inhibitor，induces cell cycle arrest and subsequent apoptosis in refractory human pancreatic cancer cells［J］.Int J Oncol，2004，24(3):679-685.

［12］Yamaguchi Y，Watanabe H，Yrdiran S，Ohtsubo K，Motoo Y，Okai T，et al.Detection of mutations of p53 tumor suppressor gene in pancreatic juice and its application to diagnosis of patients with pancreatic cancer:comparison with K-ras mutation［J］.Clin Cancer Res，1999，5(5):1147-1153.

［13］Ambrosini G，Adida C，Sirugo G，Altieri DC.Induction of apoptosis and inhibition of cell proliferation by survivin gene targeting［J］.J Biol Chem，1998，273(18):11177-11182.

［14］Wang Z，Zhang Y，Li Y，Banerjee S，Liao J，Sarkar FH.Down-regulation of Notch-1 contributes to cell growth inhibition and apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Mol Cancer Ther，2006，5(3):483-493.

［15］Greenblatt DY，Cayo MA，Adler JT，Ning L，Haymart MR，Kunnimalaiyaan M，et al.Valproic acid activates Notch1 signaling and induces apoptosis in medullary thyroid cancer cells［J］.Ann Surg，2008，247(6):1036-1040.

［16］Limb GA，Matter K，Murphy G，Cambrey AD，Bishop PN，Morris GE，et al.Matrix metalloproteinase-1 associates with intracellular organelles and confers resistance to lamin A/C degradation during apoptosis［J］.Am J Pathol，2005，166(5):1555-1563.