張秀麗，于德紅，劉德勝，劉秀珍，張樹平

(1.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生物制藥教研室，山東 煙臺 264003;2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100871;3.河北聯(lián)合大學(xué)藥學(xué)院，河北 唐山 006300)

帕金森病(Parkinson disease，PD)的臨床癥狀以靜止性震顫、運動遲緩、肌張力增高和姿勢平衡障礙等為主要特征，病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失、殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)路易小體。該病嚴重影響患者的運動和生活能力，并能導(dǎo)致殘障。雖然目前對于PD的發(fā)病機制并不十分清楚，但流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露于環(huán)境毒素如殺蟲劑中的人群，患PD的概率會大大增加［1］。

魚藤酮(rotenone)是從魚藤的根部提取的一種天然殺蟲劑，具有親脂性，可透過血腦屏障，對腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性具有抑制作用［2］。鑒于PD是一種神經(jīng)功能障礙性疾病，與細胞線粒體異常有關(guān)，因此，作為線粒體復(fù)合物抑制劑的魚藤酮可能是PD發(fā)病的潛在致病因素。研究表明，魚藤酮對線粒體復(fù)合物的抑制作用可以導(dǎo)致大量的自由基和凋亡誘發(fā)因子的產(chǎn)生，二者均可引起神經(jīng)元退變，業(yè)已證實PD患者的黑質(zhì)紋狀體線粒體復(fù)合物的活性確有明顯下降。因此，利用魚藤酮模擬的PD動物模型被廣泛用于疾病的發(fā)病機制和治療藥物研究［3］。

梓醇(catalpol)是一種環(huán)烯醚萜類的小分子化合物，研究表明，梓醇能夠抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)誘導(dǎo)的中腦多巴胺神經(jīng)元損傷［4］，提高腦室注射淀粉樣 β蛋白(amyloid beta protein，Aβ)誘導(dǎo)損傷的小鼠學(xué)習(xí)記憶能力［5-6］。近期研究發(fā)現(xiàn)，梓醇對蛋白酶體抑制劑乳胞素(lactacystin)誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用，其機制可能與梓醇提高SH-SY5Y細胞內(nèi)20S蛋白酶體含量有關(guān)［7］。

線粒體作為細胞能量轉(zhuǎn)換和物質(zhì)氧化的場所，是維持細胞以至整個機體生理功能的能源基礎(chǔ)，也是體內(nèi)活性氧自由基的主要來源。當線粒體功能受損時，細胞能量轉(zhuǎn)換不足，ATP合成降低，導(dǎo)致細胞以至整個機體生理功能的降低。PD患者腦黑質(zhì)中酶復(fù)合體Ⅰ異常，導(dǎo)致自由基增多，損害線粒體膜及mtDNA，進而引起能量合成障礙，這又將導(dǎo)致大量的自由基生成，從而形成惡性循環(huán)。此外，自由基還可損害細胞膜，破壞細胞結(jié)構(gòu)的完整性以及損害溶酶體膜，引起溶酶體的釋放，水解細胞內(nèi)物質(zhì)，造成黑質(zhì)細胞的死亡。本研究旨在探討梓醇對魚藤酮引起的神經(jīng)損傷是否有效，重點考察其對線粒體呼吸鏈復(fù)合酶活性的影響以及線粒體自由基生成和線粒體膜電位的變化，以期為梓醇在PD疾病的藥物開發(fā)和基礎(chǔ)研究中提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級昆明種小鼠(24只)，雌雄各半，體質(zhì)量(25.0±3.0)()g，購自煙臺綠葉制藥有限公司，動物合格證號:SYXK(魯)20030020。

1.2 藥物和試劑

梓醇，中國藥品生物制品檢定所;魚藤酮，Sigma公司;mtNOS和線粒體膜電位檢測試劑盒，南京建成生物工程公司。魚藤酮以二甲亞砜(DMSO，上海華藍化學(xué)科技有限公司)溶解后加入等量聚乙二醇(PEG400，北京化學(xué)試劑公司)。

1.3 動物分組及給藥

小鼠分籠喂養(yǎng)于室內(nèi)，光照12 h，溫度23～27℃，自由進食進水，適應(yīng)5 d后進行實驗。將小鼠隨機分為正常對照組、魚藤酮模型組、梓醇治療組和預(yù)防組，每組雌雄各半(共6只)。梓醇預(yù)防組，ip給予梓醇10 mg·kg-1，連續(xù)7 d后，改ip給予魚藤酮1.5 mg·kg-1，連續(xù) 28 d;魚藤酮模型組和梓醇治療組ip給予魚藤酮1.5 mg·kg-1，連續(xù)28 d后，改 ip給予DMSO或梓醇10 mg·kg-1，連續(xù)7 d。

1.4 小鼠腦組織線粒體的制備及蛋白質(zhì)含量測定

最后一次藥物注射結(jié)束后，應(yīng)用乙醚將小鼠深度麻醉，用100 ml冰冷的生理鹽水經(jīng)心臟做顱內(nèi)灌注，在冰袋上小心快速剝離中腦和紋狀體，-70℃冰箱內(nèi)保存。分離線粒體時取組織稱重后按1∶9(W/V)比例加入預(yù)冷的勻漿液(mmol·L-1:蔗糖250，EDTA 0.5，Tris-HCl 10，pH 7.4)置于玻璃勻漿器中冰浴手動勻漿。2000×g離心3 min，取上清液，12000×g離心8 min。將沉淀仔細懸于Ficoll梯度中，11500×g離心30 min，棄上清液，沉淀用勻漿液洗1次，12000×g離心8 min，所得沉淀即為線粒體。以上所有操作均在4℃進行?？捡R斯亮藍法測定線粒體懸液的蛋白含量，調(diào)整濃度為線粒體蛋白2 g·L-1。將線粒體懸液分裝后-70℃保存，保存時間不超過2周。

1.5 線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅱ+Ⅲ和Ⅳ活性的測定

將線粒體蛋白于測定前置于20℃/-20℃反復(fù)凍融3次，使之成為線粒體膜片段以進行線粒體呼吸鏈復(fù)合體酶活性測定。

呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅰ活性測定是通過加入外源性NADH和泛醌模擬電子轉(zhuǎn)運過程而實現(xiàn)的，反應(yīng)時NADH脫電子轉(zhuǎn)變?yōu)镹AD+，在340nm處吸光度下降。CoQ10(60 μmol·L-1)，抗霉素 A(2 mg·L-1)，牛血清白蛋白(2.5 g·L-1)，NADH 130 μmol·L-1加入反應(yīng)緩沖體系(mmol·L-1:KH2PO435;MgCl25;Na3N 2.1，pH 7.2)中，30℃ 溫孵 3 min。加入30～50 μg線粒體蛋白啟動反應(yīng)，1 min內(nèi)連續(xù)測定A340nm值的變化，根據(jù)1 min A340nm值的變化反映呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅰ的活性，單位μmol·min-1·g-1蛋白。

酶復(fù)合體Ⅱ活性的測定:是通過加入外源性琥珀酸和泛醌模擬電子轉(zhuǎn)運過程而實現(xiàn)的。測定的原理為:反應(yīng)時DCPIP接受電子，在600 nm處吸光度下降;酶復(fù)合體Ⅱ+Ⅲ活性的測定:實驗體系中加入外源性琥珀酸和鐵氰化鉀，電子通過復(fù)合體Ⅱ和Ⅲ進行傳遞，通過檢測鐵氰化鉀在420 nm處吸光度的變化來計算琥珀酸-鐵氰鹽還原酶活性;酶復(fù)合體Ⅳ活性的測定:實驗體系中加入外源性還原型細胞色素c，最終將電子轉(zhuǎn)移給氧氣生成水;自身則轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸图毎豤。通過檢測氧化型細胞色素c 550 nm處吸光度的變化即可計算該酶復(fù)合體的活性，單位 μmol·min-1·g-1蛋白。

呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅱ/Ⅲ活性測定:鐵氰化鉀(50 mmol·L-1)，抗霉素 A(2 mg·L-1)，琥珀酸鈉(20 mmol·L-1)，牛血清白蛋白(1.5 g·L-1)，魚藤酮(2 mg·L-1)加入反應(yīng)緩沖體系(mmol·L-1:KH2PO40.1;HEPES 10;KCl 130;EDTA 1，pH 7.2)中，30℃ 溫孵 10 min。加入線粒體蛋白50～200 μg啟動反應(yīng)，1 min內(nèi)連續(xù)測定 A420nm值的變化。以1 min A420nm值的變化反映呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅱ活性，單位 μmol·min-1·g-1蛋白。

呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅳ活性測定:線粒體蛋白40 ～60 μg加入反應(yīng)緩沖體系(8.8 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液，pH 7.0)加入0.1%還原型細胞色素c(以過量維生素C還原至A550nm/A565nm＞12)啟動反應(yīng)，1 min內(nèi)連續(xù)測定細胞色素c A550nm值的變化，反映呼吸鏈復(fù)合體酶Ⅳ的活性，單位μmol·min-1·g-1蛋白。

1.6 線粒體一氧化氮合酶(mitochondrial nitric oxide synthase，mtNOS)活性的測定

mtNOS活性的測定利用專用的試劑盒，根據(jù)操作提示完成(南京建成生物工程研究所)。酶活定義為每毫克組織蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個mtNOS 活力單位(U)，即 kU·g-1蛋白。

1.7 線粒體膜電位的測定

線粒體膜電位采用熒光染料羅丹明123進行檢測［8］。反應(yīng)緩沖液(mmol·L-1:蔗糖15，MgCl25;琥珀酸鈉 5;K2HPO45;HEPES 20;pH 7.4)90 μl，10 μl羅丹明 123100 mg·L-1，加入線粒體蛋白10 μg室溫放置30 min(避光)后于熒光酶標儀上檢測羅丹明123的熒光強度(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm)。每組結(jié)果用其熒光強度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)占正常對照組FI的百分比表示。

1.8 線粒體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的測定

ROS水平的變化使用2'，7'-二氯熒光素二乙酸(DCF-DA)檢測［9］。用 HEPES 緩沖液(mmol·L-1:NaCl 120，KCl 2.5，NaH2PO41.2，MgCl20.1，NaHCO35.0，葡萄糖 6.0，CaCl21.0，HEPES 10，pH=7.4)170 μl將線粒體 1 ～ 10 μg 混勻，加入DCF-DA(終濃度 1 mmol·L-1)，30℃放置 30 min，于GENIOS熒光酶標儀上檢測DCFH-DA的熒光強度(激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm)。每組結(jié)果用其FI占正常對照組FI的百分比表示。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 梓醇對魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅱ+Ⅲ和Ⅳ活性的影響

表1結(jié)果顯示，與正常組相比，魚藤酮模型組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性下降(P＜0.01)。與魚藤酮模型組相比，梓醇治療組和梓醇預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ活性上升(P＜0.01);線粒體復(fù)合物Ⅳ活性也表現(xiàn)上升趨勢，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)。與正常組比較，模型組、梓醇治療組和梓醇預(yù)防組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅱ和Ⅱ+Ⅲ活性變化不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab.1 Effect of catalpol on mitochondrial complex activities in mesencephalon and striatum in mice induced by rotenone

2.2 梓醇對魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位的影響

表2結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體膜電位下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比較，梓醇治療組和預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

Tab.2 Effect of catalpol on mitochondrial membrane potential level in mesencephalon and striatum in mice induced by rotenone

2.3 梓醇對魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體mtNOS活性的影響

表3結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠造模后中腦和紋狀體mtNOS活性顯著升高(P＜0.05或P＜0.01);與模型組相比較，梓醇治療組和預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體mtNOS活性顯著降低，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

Tab.3 Effect of catalpol on mtNOS in mesencephalon and striatum in mice induced by rotenone

2.4 梓醇對魚藤酮致小鼠中腦和紋狀體線粒體ROS的影響

表4結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠造模后中腦和紋狀體線粒體內(nèi)ROS的生成顯著增多(P ＜0.05或 P ＜0.01);與模型組相比較，梓醇治療組和預(yù)防組小鼠中腦和紋狀體線粒體內(nèi)ROS的生成顯著減少(P ＜0.05)。

Tab.4 Effect of catalpol on formation of reactive oxygen species(ROS)in mesencephalon and striatum mitochondria in mice induced by rotenone

3 討論

線粒體是細胞內(nèi)一個重要的細胞器，是細胞進行呼吸鏈、電子傳遞、三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化的主要場所。其內(nèi)膜上的線粒體酶復(fù)合體Ⅰ～Ⅴ組成線粒體呼吸鏈氧化磷酸化系統(tǒng)，產(chǎn)生能量，維持細胞的正常功能。酶復(fù)合體Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ在能量代謝中起著重要作用，它們活性的改變必將影響能量代謝，且它們的功能變化直接或間接地反映線粒體的呼吸功能變化。許多研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激與帕金森發(fā)病密切相關(guān)［10-11］。因此研究線粒體呼吸鏈上酶活性的變化對研究線粒體功能障礙具有重要的意義。

線粒體參與各種各樣的細胞內(nèi)反應(yīng)，其中會有超氧負離子、羥基自由基和過氧化氫的產(chǎn)生。這些ROS能夠?qū)е卵趸瘧?yīng)激，從而進一步損害細胞內(nèi)物質(zhì)。特別是線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ與超氧化物的產(chǎn)生密切相關(guān)。復(fù)合物活性的抑制會導(dǎo)致自由基產(chǎn)生的增多。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，當機體內(nèi)的氧化產(chǎn)物超過內(nèi)源性抗氧化物時，會導(dǎo)致細胞組織發(fā)生氧化損傷。活性氧可引發(fā)多不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，影響細胞的功能，甚至導(dǎo)致細胞死亡［12］。在PD的研究過程中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒素魚藤酮由于其自身的親脂性，可以透過血腦屏障，抑制腦組織線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ功能，使活性氧物質(zhì)等產(chǎn)生增加，導(dǎo)致多巴胺神經(jīng)元損傷、死亡，引起和臨床類似PD的癥狀，大量體內(nèi)體外實驗結(jié)果表明魚藤酮可以作為制備PD動物模型的神經(jīng)毒素［13-14］。

本研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮可導(dǎo)致小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性的下降，ROS產(chǎn)生增多;但對復(fù)合物Ⅱ和Ⅱ+Ⅲ活性無顯著影響。梓醇治療7 d和梓醇預(yù)處理7 d的小鼠中腦和紋狀體線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ活性都較模型組有所提高，ROS的產(chǎn)生顯著降低，而線粒體復(fù)合物Ⅱ和Ⅱ+Ⅲ活性與正常組比較沒有顯著性差異。說明梓醇通過提高線粒體復(fù)合酶Ⅰ和Ⅳ活性，使呼吸鏈功能趨于正常，進而減少了線粒體ROS生成。

線粒體膜電位是維護線粒體內(nèi)外物質(zhì)平衡、保持線粒體功能正常活動所必需的。一旦線粒體膜電位下降或者消散，各種凋亡相關(guān)因子，如細胞色素c、凋亡蛋白酶激活因子、凋亡誘導(dǎo)因子等，都從線粒體釋放出來，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，最終觸發(fā)神經(jīng)元凋亡［15］。本實驗發(fā)現(xiàn)魚藤酮可導(dǎo)致小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位顯著下降;梓醇治療7 d和梓醇預(yù)處理7 d的小鼠中腦和紋狀體線粒體膜電位顯著上升。

mtNOS催化L-精氨酸生成的NO，也是ROS的一種。mtNOS及其產(chǎn)生的NO在神經(jīng)退行性疾病如帕金森病中具有重要作用［16］。本研究發(fā)現(xiàn)魚藤酮可導(dǎo)致小鼠中腦和紋狀體線粒體內(nèi)膜上的mtNOS活性升高;梓醇治療7 d和梓醇預(yù)處理7 d的小鼠中腦和紋狀體mtNOS活性顯著降低。

梓醇是從天然藥物地黃中分離的環(huán)烯醚萜類化合物，我們前期研究發(fā)現(xiàn)梓醇在阿爾茨海默病和PD等神經(jīng)退行性疾病中的活性作用，能抑制1-甲基-4-苯基吡啶［4］和脂多糖引起的原代培養(yǎng)的中腦多巴胺神經(jīng)元凋亡［17］，還能提高 D-半乳糖損傷小鼠皮質(zhì)內(nèi)源性抗氧化酶的活性和線粒體功能［18-19］。本研究從線粒體酶活性的角度觀察梓醇對PD小鼠中腦和紋狀體的保護作用，從結(jié)果可以推測梓醇可能通過阻止線粒體酶復(fù)合體活性的下降，減少線粒體內(nèi)ROS的生成，抑制線粒體膜電位的下降，進而維持線粒體的功能，以減緩PD的發(fā)展。

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