趙瑜敏，張明珠，稅艷青，陳立忠，崔平平，雷雅燕

(云南 昆明:1.市口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，650600;2.昆明醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，650031)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，斑塊一旦破裂可觸發(fā)急性冠狀動脈硬化(acute coronary sclerosis，ACS)的發(fā)生，表現(xiàn)為不穩(wěn)定心絞痛、急性心肌梗塞和猝死。目前已認識到，AS的發(fā)生不僅有血脂參與，且有炎癥參與［1］。牙周炎是由牙周致病菌導(dǎo)致的一種炎癥性疾病，臨床流行病學(xué)研究顯示，牙周炎與動脈粥樣硬化之間存在著明顯的相關(guān)性;臨床實驗和動物實驗均發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣斑塊中存在牙周致病菌感染，因此，牙周炎已被認為是心血管疾病獨立的危險因素之一［2］。關(guān)于AS與牙周炎的關(guān)系，目前的研究多集中在兩種疾病在炎癥因子方面的規(guī)律，認為炎癥因子可能為二者之間相關(guān)性的中介和橋梁。AS形成及血管成形術(shù)(angioplasty)后再狹窄(restenosis，RS)是多細胞，多因子參與的以血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增生為主要病理改變的動脈壁病變。VSMCs是構(gòu)成大、中動脈血管中膜的重要細胞，其增殖，遷移和分泌細胞外基質(zhì)等功能在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，但關(guān)于牙周炎致病因子如內(nèi)毒素等影響VSMCs分泌炎性細胞因子的作用機制的研究較少，因此，研究 Pg等牙周致病菌的致病因子對VSMCs分泌炎性細胞因子的影響對闡明牙周炎與動脈粥樣硬化的關(guān)系有著重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277株(四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院國家重點實驗室);抗人肌動蛋白Actin免疫組化單克隆抗體(福建邁新);Rabbit IL－1β ELISA KIT、Rabbit IL－6 ELISA KIT(R＆D 公司，美國);高純總 RNA快速提取試劑盒(離心柱型，北京遠泰生物技術(shù)有限公司);TaKaRa PrimeScript One Step RT－PCR Kit Ver.2(TaKaRa 公司);兔 βactin、IL－1β，IL－6 引物(大連寶生物公司)。

1.2 Pg的培養(yǎng)及上清的提取

Pg標(biāo)準(zhǔn)菌株常規(guī)復(fù)蘇后，接種于加有羊血和Vit K1的 CDC培養(yǎng)板上，37℃，厭氧 (50 mL/L CO2)培養(yǎng)72 h。形態(tài)學(xué)檢查后，挑取菌落在BHI液體培養(yǎng)基中增菌24 h，取100 μL菌液在FT中以1/10的比例倍比稀釋至原始濃度的10－7，取10－5、10－6、10－7三個濃度的稀釋液各 100 μL 分別在CDC培養(yǎng)板上涂板，培養(yǎng)48 h后計數(shù)菌落數(shù)，推算出原始菌液的濃度。其余增菌菌液8000 r/mim，4℃離心15 min，離心后取Pg上清過濾后分裝入1.5 mL EP管，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 VSMCs的原代培養(yǎng)和鑒定

取體質(zhì)量2～3 kg的雄性日本大耳白兔，麻醉后耳緣靜脈注射空氣栓塞處死，剖腹，切取5 cm的腹主動脈，PBS洗凈后剝?nèi)パ芡饽?，?.5 g/L胰酶溶液中將其剪成1 mm×1 mm的組織塊，加入約3 mL含200 mL/L FBS的DMEM－F12培養(yǎng)液，1.5 h 后加入 2.0 mL DMEM－F12 培養(yǎng)基(含200 mL/L FBS，1%雙抗)，在 37 ℃，50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。5 d換液，直至細胞游出形成單層，2.5 g/L胰酶－EDTA消化后傳代。取第3代細胞進行抗α－Actin蛋白免疫組化染色和透射電鏡觀察鑒定細胞來源。第3～第8代細胞用于實驗。

1.4 Pg 對 VSMCs分泌 IL－1β、IL－6 的影響

取VSWCs以5×105/mL的密度接種于96孔板，每孔 100 μL。37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng) 24 h。棄原培養(yǎng)基，設(shè)12、24、48 h三個時間段，每個時間段設(shè)實驗組和對照組，每組復(fù)6孔。實驗組加入用含50 mL/L FBS的 DMEM－F12培養(yǎng)基稀釋至4.3 ×106CFU/mL 的 Pg 上清液 200 μL，對照組加入等量的含50 mL/L FBS的DMEM－F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后12、24、48 h ELISA檢測IL－1β和 IL－6 水平。

1.5 Pg 上清液對 VSMCs IL－1β、IL－6 基因表達的影響

取VSWCs消化后以2×104/mL的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后棄原來培養(yǎng)液，實驗組加入用含50 mL/L FBS的DMEM－F12培養(yǎng)基稀釋為4.3×106CFU/mL的Pg上清液5 mL，對照組加入等量的含50 mL/L FBS的DMEM－F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后12、24、48 h提取細胞總RNA，用下列引物(表1)進行一步法RT－PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:50℃ 30 min，94℃ 2 min，94℃ 30 s，59℃(IL－1β 及 β－actin)或65 ℃(IL－6)30 s，72℃ 1 min(上述三步進行30次)，72℃ 7 min。反應(yīng)產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳60 min，計算機圖像采集系統(tǒng)拍照，掃描反應(yīng)產(chǎn)物條帶的灰度值。

表1 IL－1、IL－6、β－actin 引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，兩兩比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs形態(tài)觀察和細胞鑒定

VSMCs原代培養(yǎng)5～7 d后組織塊周圍有細胞游出，為長梭形或多角形，繼續(xù)培養(yǎng)可見細胞復(fù)層分布。約20 d后，細胞長滿，可見細胞呈“峰谷樣”生長(圖1)。對第3代細胞進行α－Actin蛋白免疫組化鑒定及透射電鏡觀察顯示，抗肌動蛋白α－Actin染色陽性(圖2);透射電鏡可見肌細胞特征性結(jié)構(gòu)——密斑(圖3)。

圖1 原代細胞(×40)

圖2 抗肌動蛋白 α－Actin染色陽性，胞漿為棕色(×100)

圖3 胞漿內(nèi)見密斑及肌胞絲，并可見平滑肌細胞的特征性結(jié)構(gòu)—密斑(透射電鏡×12000)

2.2 Pg 上清對VSMCs分泌IL－1β 和 IL－6的影響

2.2.1 各時間點IL－1β 水平比較(圖4)

實驗組與對照組相比，在培養(yǎng)12 h和48 h時，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而在培養(yǎng)24 h時，實驗組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗組不同培養(yǎng)時間之間相比，以48 h時最高，12 h時次之，24 h時最低。24 h分別與12 h和48 h相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;而12 h與48 h相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2.2 各時間點IL－6水平比較(圖5)

實驗組與對照組相比，除培養(yǎng)12 h時兩者無顯著性差異(P＞0.05)外，在培養(yǎng)24 h和48 h兩時間點，實驗組均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗組不同培養(yǎng)時間之間相比，以24 h最高，48 h次之，12 h最低，3時間點之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

圖4 Pg上清對VSMCs分泌IL－1β的影響

圖5 Pg上清對VSMCs分泌IL－6的影響

2.3 Pg 上清液對VSMCs IL－1β、IL－6 基因表達的影響(圖6)

用目的基因條帶與內(nèi)參β－actin條帶的灰度值的比值作為目的基因表達強弱的指標(biāo)，分別比較各組各時間點IL－1β和IL－6 mRNA表達水平。

2.3.1 各時間點IL－1β mRNA水平比較(圖7)

實驗組與對照組相比，在培養(yǎng)12 h和48 h時兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而在培養(yǎng)24 h，實驗組明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。實驗組不同培養(yǎng)時間相比，24 h時明顯低于12 h和48 h，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);而其他兩時間點之間相比無顯著性差異(P＞0.05)。

圖6 RT－PCR 檢測 IL－1β，IL－6 表達情況

圖7 IL－1β mRNA表達情況

2.3.2 各時間點IL－6 mRNA水平比較(圖8)

實驗組與對照組相比，在培養(yǎng)12 h和48 h時兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而在培養(yǎng)24 h時，實驗組明顯高于對照組(P＜0.05)。實驗組不同培養(yǎng)時間相比，24 h明顯高于12 h和48 h(P＜0.05);而其他兩時間之間相比無顯著性差異(P＞0.05)。

圖8 IL－6 mRNA表達情況

3 討論

AS是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，斑塊一旦破裂可觸發(fā)ACS發(fā)生，表現(xiàn)為不穩(wěn)定心絞痛、急性心肌梗塞和猝死。VSMCs在眾多趨化、活化因子的作用下發(fā)生遷移和表型轉(zhuǎn)變，以自分泌、旁分泌的形式合成生長因子、細胞因子，促進氧化低密度脂蛋白(oxLDL)的產(chǎn)生和泡沫細胞形成，參與AS的發(fā)生與發(fā)展［3－5］。在促進 AS和 RS發(fā)生、發(fā)展的眾多因素中，炎癥和細胞因子是主要危險因素之一，其中以TNF－α、IL－1與AS的關(guān)系較為密切。血液炎性細胞和血管內(nèi)皮細胞和VSMCs均能分泌TNF－α、IL－6、IL－8 和血小板活化因子(platelet activativc factor，PAF)，這些因子之間具有復(fù)雜的交互作用［3］。

牙周炎是由牙周致病菌導(dǎo)致的一種炎癥性疾病，Pg是目前公認的引起牙周炎的常見致病菌，表達多種潛在的毒力因子，魯維希［6］等對Pg等牙周致病菌的BHI增菌液進行高速離心(15000 r/min，10 min)后，取其上清液用核磁共振代謝圖譜法研究發(fā)現(xiàn)，Pg菌液的上清液內(nèi)保留了其主要致病成分，所以，本研究選擇Pg上清液與VSMCs共同培養(yǎng)，觀察其對VSMCs合成和分泌IL－6和 IL－1β的影響。

有研究顯示，IL－6是慢性炎癥的關(guān)鍵分子，與AS的進展密切相關(guān)，在急性心肌梗死、RS冠脈病變部位的旋切標(biāo)本中IL－6表達增加;AS脂質(zhì)條紋、斑塊的纖維帽、肩部的巨噬細胞以及VSMCs均表達IL－6［7］。IL－6可刺激基質(zhì)降解酶的合成而侵蝕斑塊內(nèi)的基質(zhì)，導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊破裂［8］。Seino等(1994)發(fā)現(xiàn)了IL－6在人動脈粥樣硬化斑塊中的表達，并認為IL－6作為自分泌遞質(zhì)參與了冠狀動脈粥樣硬化的形成，而且同斑塊的穩(wěn)定性有關(guān)，是 AS 一個獨立的生物學(xué)標(biāo)志［9］。Ikeda等［10］臨床研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊中有IL－6 mRNA的大量表達。Biasucci等［11］發(fā)現(xiàn)冠心病病人血漿內(nèi)的IL－6水平明顯增高。

楚玉峰等［12］報道，用LPS刺激大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞3 h，即可使IL－6 mRNA和蛋白質(zhì)表達明顯增高，12 h達到高峰，24 h后雖有所降低但仍高于對照組。作者認為用LPS刺激VSMCs早期即可明顯增強IL－6轉(zhuǎn)錄水平，并進一步導(dǎo)致IL－6的蛋白合成明顯增加，而且該作用可延續(xù)至24 h 以上，與 Yang［13］、Son 等［14］的研究結(jié)論相一致。

本研究通過ELISA和RT－PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Pg上清刺激VSMCs 24 h時實驗組的IL－6 mRNA表達水平較對照組明顯增加，而到48 h時IL－6 mRNA表達水平又恢復(fù)到正常對照組水平，據(jù)此認為，Pg可以刺激VSMCs分泌產(chǎn)生IL－6，從而在AS發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

IL－1β也是在AS發(fā)生發(fā)展中起重要作用的細胞因子。IL－1具有多種生物學(xué)功能，作用于血管內(nèi)皮細胞、VSMCs、單核細胞和中性粒細胞等，誘導(dǎo)細胞粘附分子 －1、單核細胞趨化蛋白 －1、IL－1、TNF－α的表達，增加炎癥細胞對VSMCs的粘附，促進 VSMCs增殖，參與 AS 的形成［15－17］。本研究結(jié)果顯示，Pg上清刺激VSMCs 12 h時，實驗組與對照組IL－1β水平無顯著差異，而24 h時實驗組IL－1β水平顯著低于對照組，表明該時間段Pg上清能抑制VSMCs分泌IL－1β。同時進行RT－PCR半定量分析VSMCs IL－1β mRNA表達情況也顯示，24 h時，實驗組IL－1β mRNA水平明顯低于同時間點的對照組，而且也明顯低于12 h和48 h的實驗組。提示Pg上清可能是通過影響IL－1β基因的表達而抑制VSMCs分泌IL－1β。

Pg上清刺激VSMCs 24 h時VSMCs合成和分泌IL－6顯著增加，同期IL－1β的合成和分泌顯著降低，提示這兩種細胞因子之間可能存在著相互作用。IL－6等經(jīng)gp130轉(zhuǎn)錄的細胞因子可抑制LPS誘導(dǎo) IL－1 合成［18］，這可能是本研究中 IL－1β 水平降低的原因之一。因此，可以認為Pg的致病物質(zhì)可通過直接刺激血管平滑肌細胞使其分泌IL－6等細胞因子，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮一定作用。

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