吳清平，李 琳,2,3，張菊梅，郭偉鵬

(1.廣東省微生物研究所 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室廣東省華南應(yīng)用微生物重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培育基地,廣東 廣州 510070；2.中國科學(xué)院廣州化學(xué)研究所,廣東 廣州 510301；3.中國科學(xué)院研究生院,北京 100049)

隨著人們對食品安全問題的日益關(guān)注，簡便、快速、高效的檢測手段已成為目前微生物食品安全檢測的研究熱點。磷脂酰肌醇(Phosphtidylinositol，PI)作為常見食源性致病菌中的單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)特異性顯色培養(yǎng)基底物，可與LM中特有的磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(Phosphatidylinositol phospholipase C，PI-PLC)發(fā)生特異性反應(yīng)[1],在LM顯色培養(yǎng)基上形成不透明的白色暈圈，從而達到特異性檢測LM的目的。顯色培養(yǎng)基技術(shù)解決了傳統(tǒng)檢測手段耗時長、特異性低、操作繁瑣等缺陷，具有可觀的應(yīng)用價值。

由于大豆中含有豐富的PI，且原料易得、成本低廉，因此，分離純化大豆磷脂酰肌醇對于其生物機理研究及其微生物安全檢測意義重大。鑒于此，作者綜述了大豆磷脂酰肌醇的分離純化與檢測方法研究進展，并介紹了其在LM顯色培養(yǎng)基方面的重要應(yīng)用。

1 PI的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

1.1 結(jié)構(gòu)

PI是一種甘油磷脂，具有甘油磷脂的通性，不同生物體內(nèi)的PI因甘油所連接脂肪酸鏈的不同而具有不同的結(jié)構(gòu)。PI分子含有甘油、磷酸、脂肪酸及肌醇，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

虛線A1、A2、C、D分別為磷脂酶A1、A2、C、D的酶解部位

其中R1、R2為脂肪酸，常見的有軟脂酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油酸、花生四烯酸等，α位(R1CO-)的脂肪酸一般是飽和脂肪酸，而β位(R2CO-)的脂肪酸常為不飽和脂肪酸[2]。

PI所含的肌醇都是myo-肌醇，myo-肌醇是肌醇的一種異構(gòu)體，是由6個碳原子組成的環(huán)己六醇，C1,2,3,5上連接的羥基位于肌醇分子平面的一方，C4,6上連接的羥基位于另一方；C5和C2是對稱碳原子[3]，而C1和C3、C2和C6分別具有手性關(guān)系[4]，游離狀態(tài)的肌醇分子為內(nèi)消旋分子。在PI分子中，被磷酸取代而衍生出的具有旋光性的手性分子，除生物體內(nèi)C1位取代的L-myo-肌醇-l-磷酸是L型外，其余都是D型分子。

1.2 理化性質(zhì)

PI的純凈物為白色蠟狀固體，其中含有的不飽和脂肪酸在空氣中易被氧化而變成黃褐色或黑色。PI通常以鈉鹽的形式存在，為白色晶體，且易潮解和氧化。PI的熔點約為60 ℃，不耐高溫，100 ℃以上會發(fā)生氧化分解反應(yīng)[5]，280 ℃時會生成黑色的沉淀。PI可以與碘酸發(fā)生氧化反應(yīng)而生成醛類。PI與Schiff試劑反應(yīng)生成紫紅色化合物，可作為區(qū)別于其它磷脂的特性反應(yīng)。

PI易溶于氯仿、正己烷、乙醚、甲苯，微溶于甲醇、石油醚，不溶于丙酮、乙醇。PI在弱堿性溶液中的溶解度較大。由于磷脂類分子既含有親水性的磷酸酯基，又含有疏水性的脂肪烴基，因此，可作為兩性表面活性劑包裹在油滴的表面，大幅降低油水間的界面張力，從而形成均勻穩(wěn)定的乳化液。

從結(jié)構(gòu)上看，PI具有脂肪酸、酯鍵、烷基以及肌醇上的取代基，可發(fā)生特異性化學(xué)反應(yīng)，如水解反應(yīng)、加成反應(yīng)、氧化反應(yīng)、乙?；磻?yīng)、羥基化反應(yīng)、硫酸化反應(yīng)及絡(luò)合反應(yīng)等[6]。

2 PI的分離純化方法

大豆磷脂中的主要成分為PI、磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)，通常利用它們之間極性的差異進行分離。目前常用的分離方法主要有柱層析法、溶劑萃取法、酶法等。

2.1 柱層析法

用于分離PI的柱層析法主要有硅膠柱層析、離子交換柱層析以及氧化鋁柱層析等，常用的溶劑主要有氯仿和低級醇等溶劑混合物。采用梯度洗脫的方法可以提高PI純度，也可采用低壓制備色譜柱在等度洗脫條件下分離，得到純度高達90%以上的PI。

宋華等[7]采用100 mm×26 mm色譜柱，以氯仿-甲醇(2∶1，體積比，下同)為流動相，在流速為3.0 mL·min-1的條件下分離，PI純度達到90%以上、PE純度80%以上、PC純度95%以上。姜波等[8]以氯仿-甲醇(1.8∶1)為流動相，在上樣量為1.0 g·(100 g)-1的條件下得到的PI純度可達91.5%。

將混合磷脂溶解在CHCl3-CH3OH(1∶1)中，經(jīng)Al2O3柱層析洗脫，得到含有PC、糖脂以及溶血磷脂的混合液，繼續(xù)用CHCl3-1% CH3OH-COONH4(1∶1∶0.3)溶液洗提，再用硅膠柱層析分離，可得到高純度的PI。另外，先加入洗脫液CHCl3得到中性脂質(zhì)，再加入CHCl3-CH3OH(4∶1)洗脫糖脂和部分PE，最后加入CHCl3-CH3OH-25%NH3(80∶20∶5或65∶25∶5)洗提PI，蒸發(fā)干燥，PI純度達98%～99%[9]。

2.2 溶劑萃取法

溶劑萃取法是根據(jù)所分離組分在不同有機溶劑中溶解性的差異來進行分離的。常用的溶劑有甲醇、丙酮、正己烷、異丙醇、三氯甲烷及其混合溶劑等。溶劑萃取法技術(shù)成熟、操作簡便、溶劑能回收利用、容易放大且能連續(xù)化生產(chǎn)，是傳統(tǒng)的分離PI的方法之一。

陳志強等[10]采用乙醇和正己烷萃取大豆PI，效果較佳。吳平等[11]進一步對分離條件進行了優(yōu)化，PI的純度從26%提高到73.89%。

溶劑萃取法結(jié)合柱層析法可以顯著提高PI的產(chǎn)率。柳葉[12]在溶劑萃取法分離PI的基礎(chǔ)上，將醇溶液用Al2O3處理，以甲醇-氨水(20∶1)為洗脫劑，PE的洗脫率達到32.3%。劉代成等[13]首先用堿性乙醇抽提去除混合大豆磷脂中的PE和PC；將得到的粗品溶于非極性溶劑中，加入含堿性物質(zhì)的極性溶劑，調(diào)pH值至8.0～10.0；液液萃取后，再加入金屬鹽純化，PI純度可達87.8%。

將溶劑萃取法與一些化學(xué)反應(yīng)相結(jié)合可得更高純度的PI。如將混合磷脂溶在有機溶劑(如無水吡啶、乙腈、DMF、DMSO)中，加入氯化三甲基硅、氯化二甲基叔丁基硅或烯丙基溴保護羥基，再用丙酮或乙醇將產(chǎn)物從反應(yīng)體系中萃取出來，加入酸性物質(zhì)水解，去除保護基團，恢復(fù)羥基，PI純度可達98%以上。

2.3 酶法

目前發(fā)現(xiàn)的主要有4種磷脂酶，即磷脂酶A1、A2、C和D，它們可以水解不同的酯鍵(見圖1)。

磷脂酶D作用于混合磷脂中，可以水解去除含氨基團，在特定條件下，能催化各種含羥基底物結(jié)合到磷脂的堿基上，從而形成新的磷脂，這一特性稱為磷脂酶D的磷脂轉(zhuǎn)移特性[14](Transphosphatidylation)或堿基交換反應(yīng)(Base exchange reaction)。Nakazato在磷脂酶D存在下得到純度為70%的PI[15];McGuigan[16]在醇和肌醇存在下制備PI；Juneja等[17]在L-或D-絲氨酸存在下，將PC轉(zhuǎn)化為磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)，轉(zhuǎn)化率分別為98.5%和100%。

由于磷脂酶D不會水解PI，而是選擇性地水解其它的磷脂成分(如PC和PE)，因此，將乙醇處理后的混合磷脂(含少量的PC)用磷脂酶D處理，然后用堿性或酸性磷脂酶處理，PI的純度可達60%～70%[18]。

3 PI的檢測方法

3.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法分離混合磷脂常用的固定相為硅膠；常用的流動相為乙腈-甲醇-水體系和正己烷-異丙醇-水體系[19,20]；檢測器一般采用紫外檢測，在205 nm處有較強吸收。

大豆磷脂中主要組分PC、PE以及PI的測定可依照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21493-2008進行。采用Si-60色譜柱(250 mm×2.6 mm)，填充物粒度5 μm，以正己烷-異丙醇-1%冰醋酸(8∶8∶1)為流動相，流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，采用梯度洗脫可達到更好的分離效果。

3.2 薄層層析法

郭勃等[21]采用10 cm×10 cm、10 cm×20 cm薄層展開板，采用雙向展開劑[展開劑A：氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水(35∶25∶4∶14∶2)，展開劑B：正己烷-乙醚(4∶1)]，用磷鉬酸乙醇溶液(5%～10%)或Dittmer試劑顯色對PI進行檢測。

商宗一等[22]將溶有PI的有機提取液通過2根陰陽離子交換樹脂分離柱后，再用氯仿-甲醇洗脫來分離PI。

3.3 其它檢測方法

利用超臨界色譜(SFC)[23]對PI進行分離。采用Spherisorb C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，不銹鋼柱)，流動相為CO2改性劑(10∶1)，流速1.1～1.3 mL·min-1，柱溫30～60 ℃，壓力20 MPa，檢測波長214 nm，用外標(biāo)峰面積定量法測定PI含量[24]，不僅分離效率高，且環(huán)保無污染，是一種理想的分離手段，但由于成本及技術(shù)要求高尚未得到廣泛應(yīng)用。

20世紀(jì)90年代后發(fā)展成熟的磷原子核磁共振效應(yīng)可用于分析各磷脂組分的含量，Thomas用30 mL甲醇-氯仿溶解，再用0.2 mol EDTA沉淀金屬離子，在202.4 MHz下用核磁共振分析了富集PI的磷脂組分，PI的31PNMR的化學(xué)位移為-0.37 ppm[25]。

4 PI在LM顯色培養(yǎng)基方面的應(yīng)用

近年來顯色培養(yǎng)基方法[26]相對于傳統(tǒng)檢測方法省時省力且準(zhǔn)確度高、操作簡便，得到了普遍認(rèn)可和越來越廣泛的應(yīng)用。

目前應(yīng)用最廣泛的CHROMagar Listeria顯色培養(yǎng)基、ALOA培養(yǎng)基以及OCLA培養(yǎng)基[27]等都是以PI和5-溴-4-氯-3-吲哚吡喃糖苷為底物進行檢測的。而國內(nèi)對PI作為底物的研究及應(yīng)用鮮有報道。

作者所在研究團隊近年來對常見食源性致病菌顯色培養(yǎng)基進行了深入研究，已成功研制出一系列特異性顯色培養(yǎng)基并已經(jīng)得到商品化應(yīng)用。為了進一步提高顯色培養(yǎng)基的檢測效果并降低底物成本，進行了顯色底物的自主合成研究，其中結(jié)合溶劑萃取和柱層析分離的PI純度達97%以上，與進口PI產(chǎn)品的顯色效果無明顯差異。目前，正開發(fā)特異性更高的底物以及使用多種復(fù)合底物，以進一步提高包括LM在內(nèi)的特異性底物顯色培養(yǎng)基的檢測特異性和靈敏度。

5 結(jié)語

由于大豆磷脂中含有性質(zhì)相似的多種磷脂類物質(zhì)，包括磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)等，且市售的混合磷脂中PI的含量一般只有10%左右，不能直接應(yīng)用到顯色培養(yǎng)基中；同時大豆磷脂原料中的幾種組成成分都具有磷脂類化合物的通性且結(jié)構(gòu)具有相似部分，因此，采用常規(guī)方法難以得到純度較高的單一磷脂；另外，磷脂類化合物PI含有的肌醇結(jié)構(gòu)以及不飽和脂肪鍵等使其具有容易氧化、不耐高溫等缺點，在分離制備過程中容易變性，從而更增加了分離難度。

溶劑法具有操作簡便、便于工業(yè)化的優(yōu)點，但是溶劑消耗量大、生產(chǎn)成本高；柱層析法分離效率高，但負(fù)載量小、可重復(fù)性差；高效液相色譜法雖可制備少量PI純品，但成本較高、操作復(fù)雜、產(chǎn)量很少，還停留在實驗室少量分析階段。因此尋找可行的高效分離手段成為目前亟待解決的問題。

國內(nèi)LM顯色底物制備方面的研究相對落后，直接制約了其在LM檢測顯色培養(yǎng)基方面的應(yīng)用。隨著研究的深入，將兩種以上的分離方法相結(jié)合來提高分離純度及酶解法制備PI均具有一定的發(fā)展?jié)摿?。隨著PI需求的增加，開發(fā)簡便可行的高純度制備工藝將成為未來研究的發(fā)展方向。

[1] Aurora R，Prakash A，Prakash S，et al.Comparison of PI-PLC bas-ed assays and PCR along withinvivopathogenicity tests for rapid detection of pathogenicListeriamonocytogenes[J].Food Control，2008，19(7)：641-647.

[2] Gerelli Y，Di Bari M T，Deriu A，et al.Structure and organization of phospholipid/polysaccharide nanoparticles[J].Journal of Physics:Condensed Matter，2008，20(10)：104-211.

[3] de Meyer F,Smit B.Effect of cholesterol on the structure of a phospholipid bilayer[J].PNAS,2009，106(10)：3654-3658.

[4] Anderson R J,Groundwater P W,Huang Y,et al.Synthesis and evaluation of novel chromogenic peptidase substrates based on 9-(4′-aminophenyl)-10-methylacridinium salts as diagnostic tools in clinical bacteriology[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2008，18(2)：832-835.

[6] Liu Y C,Mihai C,Kubiak R J,et al.Phosphorothiolate analogues of phosphatidylinositols as assay substrates for phospholipase C[J].ChemBioChem，2007，8(12)：1430-1439.

[7] 宋華，陳福明.柱層析法分離大豆磷脂[J].中國油脂，2005，30(2)：41-43.

[8] 姜波，胡志雄，張維農(nóng),等.柱色譜法制備高純大豆肌醇磷脂研究[J].糧油加工，2009，(7)：77-80.

[9] 鄧啟剛，齊樂，安紅.大豆肌醇磷脂的分離技術(shù)研究[J].化學(xué)工程師，2003，(6)：14-16.

[10] 陳志強，安紅，何錫鳳.溶劑法分離制備大豆肌醇磷脂[J].齊齊哈爾大學(xué)學(xué)報，2005，21(2)：1-4.

[11] 吳平，安紅，何錫鳳，等.大豆肌醇磷脂制備優(yōu)化條件的研究[J].中國油脂，2006，31(6)：87-89.

[12] 柳葉.氧化鋁柱層析分離純化磷脂的工藝優(yōu)化[D].杭州：浙江大學(xué)，2006.

[13] 劉代成，安立國，陶務(wù)端，等.高純度磷脂酰肌醇的制備方法[P].CN 1 560 057,2005-01-05.

[14] Shashidhar M S，Volwerk J J，Griffith O H,et al.A chromogenic substrate for phosphatidylinositol-specific phospholipase C：4-Nitrophenyl myo-inositol-1-phosphate[J].Chemistry and Physics of Lipids，1991，60(2)：101-110.

[15] Row K H，Kang D H.Normal-phase high-performance liquid ch-romatography of phospholipids from soybean with evaporative light scattering detection[J].American Biotechnology Laboartory，2003,21(9):40-42.

[16] McGuigan C.A new and rapid synthesis of phospholipids[J].J Chem Soc Chem Commun，1986,(7):533-534.

[17] Juneja L R,Kazuoka T,Goto N,et al.Studies on the enzymic conversion of phospholipids(Ⅵ).Conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylserine by various phospholipase D in the presence of L- or D-serine[J].Biochem Biophys Acta(BBA)-Lipids and Lipid Metabolism，1989，1003(3)：277-283.

[18] Van der Meeren P，Vanderdeelen J，Huys M，et al.Simple and ra-pid method for high-performance liquid chromatographic separation and quantification of soybean phospholipids[J].J Chromatogr A，1988，447(2):436-442.

[19] Olsson P，Holmb?ck J，Hersl?f B.Separation of lipid classes by HPLC on a cyanopropyl column[J].Lipids，2012，47(1)：93-99.

[20] Chen C B，Yang L Q，Zhou J.Trace bensulfuron-methyl analysis in tap water，soil，and soybean samples by a combination of molecularly imprinted stir bar sorption extraction and HPLC-UV[J].Journal of Applied Polymer Science，2011，122(2)：1198-1205.

[21] 郭勃，徐桂云，常理文.大豆磷脂組成的薄層色譜分析[J].分析化學(xué)，1998，26(1)：81-84.

[22] 商宗一，張金紅.樹脂法分離純化植物磷脂酰肌醇的新工藝[P].CN 86 101 623，1987-09-23.

[23] 陽東升,陳良才，劉根凡，等.用超臨界二氧化碳萃取技術(shù)制備蛋黃卵磷脂的幾種工藝探討[J].現(xiàn)代化工，2003，23(10)：46-53.

[24] Wadud S，Leon-Velarde C G,Larson N,et al.Evaluation of immunomagnetic separation in combination with ALOAListeriachromogenic agar for the isolation and identification ofListeriamonocytogenesin ready-to-eat foods[J].Journal of Microbiological Methods,2010，81(2)：153-159.

[25] 王學(xué)軍，趙鎖奇，王仁安.超臨界流體色譜法分析大豆磷脂[J].色譜，2001，19(4)：344-346.

[26] Aragonalegro L，Aragon D,Martinez E,et al.Performance of a chromogenic medium for the isolation ofListeriamonocytogenesin food[J].Food Control,2008，19(5)：483-486.

[27] Becker B，Schuler S，Lohneis M,et al.Comparison of two chromogenic media for the detection ofListeriamonocytogeneswith the plating media recommended by EN/DIN 11290-1[J].International Journal of Food Microbiology，2006，109(1-2)：127-131.