王正雨，王 偉

(1.江蘇省淮安市第二人民醫(yī)院，江蘇 淮安 223002;2.江蘇正大清江制藥有限公司，江蘇 淮安 223005)

仙靈骨葆滴丸由淫羊藿、補骨脂、川續(xù)斷等組方，用于治療肝腎不足、瘀血阻絡(luò)所致骨質(zhì)疏松癥[1]，為江蘇正大清江制藥有限公司研發(fā)的中藥六類新藥。處方中淫羊藿為君藥，補骨脂為臣藥。淫羊藿苷既是淫羊藿中的主要成分，也是淫羊藿藥理活性的代表化合物，而補骨脂素與異補骨脂素亦是補骨脂中的主要活性成分，因此三者既是指標(biāo)成分又是活性成分，選擇三者作為定量控制指標(biāo)，符合國家新藥審批法規(guī)對新藥研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。筆者采用高效液相色譜法同時測定上述3個主要成分的含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters510型高效液相色譜儀。仙靈骨葆滴丸(江蘇正大清江制藥有限公司，批號分別為 050131，050201，050202，050203，050204，050217，050219，050310，050312，050314);淫羊藿苷對照品(批號為110737－200312)、補骨脂素對照品(批號為110739－200309)、異補骨脂素對照品(批號為110738－200410)均由中國藥品生物制品檢定所提供;仙靈骨葆陰性滴丸(含淫羊藿)，補骨脂陰性滴丸(自制);甲醇為色譜純，其余試劑、試藥均為分析純;水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Agela BonChrom C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－1.5%冰醋酸水溶液(55∶45);檢測波長:246 nm;流速:0.8 mL/min;進樣量:10 μL;柱溫:30 ℃ 。理論板數(shù)按補骨脂素峰、異補骨脂素峰和淫羊藿苷峰計算應(yīng)分別不低于3000、3000和 2500。

2.2 溶液制備

精密稱取淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為 0.2092，24.32，18.88 μg/mL 的混合對照品溶液。精密稱取仙靈骨葆滴丸1.0109 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇－水(50∶50)的溶液10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用上述溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密稱取不含淫羊藿和補骨脂的陰性滴丸0.9996 g，按供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗:精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液各10 μL，進樣測定。兩個相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，其他雜質(zhì)成分對樣品檢測無干擾，色譜圖見圖1。試驗結(jié)果表明，該法的專屬性良好。

檢測波長選擇:經(jīng)全波長紫外掃描結(jié)合文獻(xiàn)[2－4]得知，補骨脂素和異補骨脂素的最大吸收波長為246 nm，淫羊藿苷在270 nm處呈現(xiàn)最大吸收峰。文獻(xiàn)[5]有采用過246，270，290 nm波長進行測定，而根據(jù)方中淫羊藿和補骨酯藥材的處方量，結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，用270 nm波長同時測定這3種成分時補骨脂素及異補骨脂素的響應(yīng)值太低，而246 nm波長最理想，峰形佳，且都能較好得到分離。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察:精密稱取補骨脂素(12.16 mg)、異補骨脂素(9.44 mg)和淫羊藿苷(104.6 mg)于 50 mL容量瓶中混合，加甲醇稀釋至刻度搖勻。分別精密量取 0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mL 上述溶液至10 mL容量瓶中，制得相當(dāng)于10 μL中含補骨脂素0.0608，0.1216，0.2432，0.3648，0.4864 μg，異補骨脂素0.0472，0.0944，0.1888，0.2832，0.3776 μg，淫羊藿，0.523，1.045，2.094，3.138，4.184 μg 的線性測試液，進樣測定，以峰面積積分值(Y)對進樣量(X)進行線性回歸，得回歸方程見表1。

表1 線性關(guān)系試驗結(jié)果

精密度試驗:精密量取混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，補骨脂素、異補骨脂素、淫羊藿苷 RSD分別為0.34% ，0.53% ，1.09%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品(批號為050131)溶液，分別于 0，2，4，6，8，12 h 時進樣測定，補骨脂素、異補骨脂素、淫羊藿苷的 RSD 分別為 1.64% ，1.10% ，1.12%(n=6)。結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批樣品(批號為050131)6份，按擬訂色譜條件進行測定，補骨脂素、異補骨脂素、淫羊藿苷的 RSD分別為 2.04%，1.82%，1.40%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗:精密稱取同一批樣品(批號050131)6份，約0.3 g，置具塞錐形瓶中，分別加入一定量的補骨脂素、異補骨脂素和淫羊藿苷對照品溶液，揮干溶劑后，精密加入甲醇－水(50∶50)的溶液10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用上述溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液用微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為供試品溶液。進樣測定，結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測定

取10批樣品按2.2項下方法制備供試品溶液，分別取混合對照品溶液和各供試品溶液進樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計算，結(jié)果見表3。

表2 加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

表3 樣品含量測定結(jié)果

3 討論

曾經(jīng)以不同濃度甲醇作為提取溶劑，不同提取時間進行試驗，包括甲醇、甲醇－水(50∶50)、甲醇－水(20∶80)，提取時間包括超聲提取 0.5，1，1.5 h，測定后發(fā)現(xiàn)甲醇 － 水(50 ∶50)、超聲提取1 h提取最為合適完全，故選用甲醇－水(50∶50)超聲提取1 h。

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