史 君 王 靜 王 星 孫艷宏 范曉梅 納仁高娃

1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059；2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051

心肌肥厚主要是由于心臟在長(zhǎng)期壓力負(fù)荷過(guò)重的情況下，肥大的心肌需氧量增加，而冠狀動(dòng)脈的供血量往往不能予以滿足，造成心肌缺血從而引起心肌重構(gòu)，其發(fā)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)主要是心肌細(xì)胞增大和纖維化。它還是心力衰竭的早期重要病理過(guò)程，也是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1]。近年來(lái)隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)心肌肥厚的逆轉(zhuǎn)可以降低心血管疾病的危險(xiǎn)性[2]，且炎癥因子在心肌肥厚的形成中具有重要作用[3]，因此，心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展機(jī)制顯得尤為重要，但迄今各種炎癥因子在心肌肥厚發(fā)病機(jī)制中的確切作用尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)就細(xì)胞因子中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）在高血壓心肌肥厚大鼠血清和心肌中的表達(dá)變化進(jìn)行研究，探討TNF-α和IL-6在心肌肥厚中所表達(dá)的作用，為今后的研究及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 心肌肥厚模型的制備

內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供的Wistar大鼠180～220g 20只，均用標(biāo)準(zhǔn)顆粒性飼料喂養(yǎng)。按照預(yù)期實(shí)驗(yàn)要求喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組，即心肌肥厚組和假手術(shù)組，每組10只。參照Anderson方法制作壓力負(fù)荷性心肌肥厚大鼠模型[4]。假手術(shù)組中，利用手術(shù)分離大鼠一小段腹主動(dòng)脈后，穿過(guò)一消毒手術(shù)縫線，但不作結(jié)扎，內(nèi)臟恢復(fù)原位后關(guān)閉腹腔，繼續(xù)飼養(yǎng)。各組大鼠術(shù)后按要求飼養(yǎng)8周，以戊巴比妥鈉麻醉后稱重，斷頭取血，摘取心臟。測(cè)取左心室重計(jì)算心室重與體重比值（LVW/BW）作為心肌肥厚指數(shù)。

1.2 動(dòng)脈收縮壓（SBP）的測(cè)定

分別取各組大鼠，將其放入Power Lab系統(tǒng)配備的大鼠固定器內(nèi)，露出鼠尾，將尾根部放在烤燈下加熱5～10 min，使鼠尾動(dòng)脈充分?jǐn)U張后，將其穿過(guò)加壓尾套并固定于鼠尾根部，使大鼠尾部腹面正中與Power lab ML125／R（澳大利亞埃德儀器有限公司生產(chǎn)）無(wú)創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測(cè)定分析系統(tǒng)的脈搏傳感器緊密接觸，然后觀測(cè)系統(tǒng)的脈搏波形，當(dāng)出現(xiàn)穩(wěn)定的脈搏波時(shí)即可開(kāi)始測(cè)定血壓。動(dòng)物安靜后給尾套充氣加壓，可見(jiàn)脈搏波逐漸減小至消失，然后尾套開(kāi)始放氣，鼠套壓力降低，當(dāng)壓力等于收縮壓時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)脈搏波，此點(diǎn)的血壓值即動(dòng)脈收縮壓。重復(fù)測(cè)量3次，取平均值，以kPa表示。

1.3 血清TNF-α、IL-6水平的測(cè)定

術(shù)后飼養(yǎng)8周處死大鼠，采取斷頭取血法，抽取4 mL血樣，然后離心分離血清，-20℃保存。測(cè)定前先置室溫復(fù)融，混勻后，利用4℃ 3000 r/min離心5 min，取上清液，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（分析試劑盒由北京東雅生物技術(shù)研究所提供）加樣操作。

1.4 RT-PCR法擴(kuò)增大鼠TNF-α及IL-6基因

1.4.1 引物設(shè)計(jì)和合成 具體引物由上海申友生物公司合成，包括：β-actin上游引物 5-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3′；β-actin 下游引物 5′-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3′；TNF-α 上游引物 5′-TGT TGT AGC AAA CCC TCA AG-3′；TNF-α 下游引物 5′-AAG TAG ACC TGC CCA GAC T-3′；IL-6 上游引物 5′-CAC TCA CCT CTT CAG AAC GA-3′；IL-6 下游引物 5-TGG CAT TTG CAT TTG TGG TTG GGT-3′，以上使用前均稀釋成 10 μmol/L。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)操作步驟 取30 mg心肌組織，采用TRIZOL一步法提取組織總RNA，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織中IL-6及TNF-α基因的表達(dá)水平。RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行加樣操作。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計(jì)算機(jī)圖像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定電泳條帶密度值，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算TNF-α mRNA及IL-6 mRNA的相對(duì)含量，結(jié)果以TNF-α、IL-6條帶占β-actin條帶密度的百分率（%）表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，經(jīng)半定量處理后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，確立檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌肥厚大鼠收縮壓和心指數(shù)的變化

與假手術(shù)組比較，心肌肥厚組術(shù)后8周動(dòng)脈收縮壓升高（P ＜ 0.05），心指數(shù)明顯增加（P ＜ 0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 心肌肥厚組和假手術(shù)組SBP、LVW/BW的變化（，n=10）

表1 心肌肥厚組和假手術(shù)組SBP、LVW/BW的變化（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) SBP（kPa） LVW/BW（mg/g）心肌肥厚組假手術(shù)組101026.4±0.3*15.7±0.53.0±0.4*2.4±0.2

2.2 心肌肥厚大鼠血清中TNF-α、IL-6含量變化

腹主動(dòng)脈部分結(jié)扎手術(shù)后8周，血清TNF-α、IL-6含量增加，與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 心肌肥厚組和假手術(shù)組TNF-α、IL-6血清含量的變化（，n=10）

表2 心肌肥厚組和假手術(shù)組TNF-α、IL-6血清含量的變化（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) TNF-α（μg/L） IL-6（ng/L）心肌肥厚組假手術(shù)組10103.5±0.8*1.9±0.4443.1±176.2*174.3±30.2

2.3 心肌肥厚大鼠心肌TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的變化

PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，以反應(yīng)條帶在圖像分析系統(tǒng)內(nèi)行吸光度掃描進(jìn)行半定量分析，IL-6 mRNA及TNF-α mRNA的相對(duì)含量用兩者條帶積分的灰度值與其相應(yīng)的β-actin的灰度值之比表示。與假手術(shù)組比較，心肌肥厚組心肌的 IL-6 mRNA及 TNF-α mRNA表達(dá)增加 （P＜0.05）。 見(jiàn)表 3。

表3 RT-PCR檢測(cè)兩組心肌IL-6及TNF-α mRNA結(jié)果（，n=10）

表3 RT-PCR檢測(cè)兩組心肌IL-6及TNF-α mRNA結(jié)果（，n=10）

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05

組別 例數(shù) IL-6 mRNA TNF-α mRNA心肌肥厚組假手術(shù)組10100.51±0.05*0.22±0.030.69±0.05*0.21±0.02

3 討論

3.1 成功構(gòu)建心肌肥厚大鼠模型

心肌肥厚是指心肌細(xì)胞體積增大和心肌纖維增生[5]，是心臟對(duì)機(jī)械牽張和神經(jīng)體液刺激的一種主要反應(yīng)[6]。心肌肥大起初是一種對(duì)負(fù)荷增加或損傷的代償，但持續(xù)性心肌肥大則最終會(huì)因心功能失常而導(dǎo)致心力衰竭，因此探討其機(jī)制非常重要。本實(shí)驗(yàn)參照Anderson方法制作壓力負(fù)荷性心肌肥厚大鼠模型，選取造模8周時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]，造模4周時(shí)心肌肥厚模型已經(jīng)建成，造模8周時(shí)模型比較穩(wěn)定。筆者在前期的實(shí)驗(yàn)中分別通過(guò)造模4周和8周觀察到心肌肥厚組心肌細(xì)胞彌漫性肥大，畸形、核大、深染，心肌纖維走行紊亂，間質(zhì)增生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心肌肥厚組SBP和LVW/BW顯著升高，說(shuō)明成功制備心肌肥厚大鼠模型。

3.2 心肌肥厚大鼠血清和心肌中TNF-α、IL-6的水平變化及意義

TNF-α是炎性細(xì)胞因子之一，其具有多種效應(yīng)，目前認(rèn)為TNF-α可以誘導(dǎo)心肌肥厚[10]。TNF-α對(duì)心肌的作用復(fù)雜多樣，可致心肌細(xì)胞凋亡[11]，也可引起心肌細(xì)胞肥大[12]。TNF對(duì)膠原纖維的生成和降解進(jìn)行雙向調(diào)節(jié)[13-15]。據(jù)報(bào)道[10-11]在體外培養(yǎng)的乳鼠和成年貓科動(dòng)物的心肌細(xì)胞中，TNF-α可誘導(dǎo)心肌肥大。王桂君等[16]研究結(jié)果顯示100 μg/L TNF-α能夠誘導(dǎo)心肌肥大，表現(xiàn)為蛋白合成、蛋白含量以及細(xì)胞體積增大，并增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。IL-6也是一種炎性細(xì)胞因子，可致心肌細(xì)胞肥大，還有抗凋亡的作用。體外實(shí)驗(yàn)中IL-6可直接引起心肌成纖維細(xì)胞膠原合成的增加。Flesh等[17]在機(jī)械張力刺激的實(shí)驗(yàn)中觀察到中等程度的拉長(zhǎng)心肌細(xì)胞時(shí)IL-6輕微增加，20 min后TNF-α無(wú)變化，60 min后IL-6也不再變化，而在心肌細(xì)胞嚴(yán)重拉長(zhǎng)時(shí)則導(dǎo)致TNF-α、IL-6逐漸增加至較高水平，同時(shí)TNF-α、IL-6受體表達(dá)也增多。轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)明顯的心肌肥厚，條件是在心臟同時(shí)過(guò)表達(dá)IL-6和IL-6受體。綜上所述，炎癥因子TNF-α、IL-6參與心肌肥厚過(guò)程，但這些研究多集中于離體心臟或培養(yǎng)的心肌細(xì)胞層面，而炎癥細(xì)胞因子在疾病過(guò)程中對(duì)心臟肥大的實(shí)際效應(yīng)以及在體外實(shí)驗(yàn)和整體動(dòng)物中的參與程度和方式會(huì)有不同。本實(shí)驗(yàn)從整體水平出發(fā)，參照Anderson方法制作壓力負(fù)荷性心肌肥厚大鼠模型，選取TNF-α、IL-6兩種炎癥細(xì)胞因子，觀察它們?cè)谛募》屎翊笫笱搴托募≈械谋磉_(dá)變化。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，心肌肥厚組大鼠血清TNF-α、IL-6含量增加（P<0.05）；肥厚心肌中TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)增加（P<0.05）。提示TNF-α、IL-6參與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展，其機(jī)制可能是：縮窄大鼠腹主動(dòng)脈致心肌后負(fù)荷增加，從而使心臟做功增加，耗氧增多，代謝產(chǎn)物堆積，同時(shí)心臟神經(jīng)體液等因素的激活使核因子-κB（NF-κB）、活化蛋白-1（AP-1）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活化轉(zhuǎn)錄因子（STAT）活化[18]，可產(chǎn)生一些細(xì)胞因子及無(wú)菌性炎癥，其中包括TNF-α及IL-6的增加。而TNF-α及IL-6在心肌細(xì)胞上的異常表達(dá)，可刺激各種生長(zhǎng)因子[19-20]的表達(dá)，這些生長(zhǎng)因子作用于心肌細(xì)胞，促使其肥大[21]。實(shí)驗(yàn)中還觀察到血清和心肌中TNF-α、IL-6水平均升高，變化一致，可能是壓力負(fù)荷增加導(dǎo)致心肌中TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成增加，使得進(jìn)入血液循環(huán)的TNF-α、IL-6增多，進(jìn)一步刺激心肌肥厚產(chǎn)生。因此，從本實(shí)驗(yàn)的觀測(cè)結(jié)果可以得知：炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6參與心肌肥厚的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。

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