歐春培 利春葉 李曉文 陳國(guó)藝 賈賽雄

南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳寶安醫(yī)院上肢顯微外科，廣東 深圳 518101

缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）所致人體各個(gè)組織和器官的損傷在臨床并不少見(jiàn)，包括術(shù)中為避免出血人為阻斷組織和器官的供血后再灌注的損傷。如骨科常用止血帶限時(shí)地壓迫主要供血血管而達(dá)到四肢手術(shù)和創(chuàng)傷出血中的止血，臨床中筆者觀察到手外傷患肢正常使用止血帶，缺血再灌注后未受傷手指指甲也會(huì)出現(xiàn)畸形生長(zhǎng)，其機(jī)制尚不清楚。本研究在動(dòng)物模擬實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上探討使用止血帶后缺血再灌注對(duì)甲床的損傷及其相應(yīng)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定試劑盒和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Trizol購(gòu)自分子探針公司，RT-PCR和熒光定量檢測(cè)Real Time試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性大耳白兔 50只，體重（6.0±1.2）kg，購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、缺血30、60、90、120 min組，每組各 10只。

1.3 缺血再灌注動(dòng)物模型的制備

3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉（1 mg/kg），固定實(shí)驗(yàn)組大耳白兔，于右后肢根部上止血帶，松緊度以腘動(dòng)脈搏動(dòng)消失為準(zhǔn)，分別于缺血30、60、90、120 min再灌注1 h后剝離甲板，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 SOD活性的測(cè)定

手術(shù)取出的局部甲床組織勻漿，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，采用分光分析法檢測(cè)標(biāo)本中超氧化物歧化酶（SOD）活性[1]。

1.5 組織TNF-α基因表達(dá)的熒光定量PCR檢測(cè)

手術(shù)取出的局部甲床組織勻漿，按照Trizol和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取細(xì)胞總RNA和反轉(zhuǎn)出cDNA的第一鏈，按照Real-Time試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用ABI 7000熒光定量PCR儀檢測(cè)TNF-α基因的表達(dá)。TNF-α基因：上游引物5'-ACACCCACGTCGTAGCAAACCAC-3'，下游引物 5'-ACACCCATTCCCTTCACAGAGC-3'；內(nèi)參照GAPDH基因：上游引物 5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游引物 5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'，反應(yīng)條件為：95°C 15 s，60°C 1 min，35個(gè)循環(huán)。以內(nèi)參照計(jì)算△Ct值，△Ct值越小說(shuō)明基因拷貝數(shù)越多[2]。

1.6 甲床組織細(xì)胞凋亡的TUNEL檢測(cè)

手術(shù)取出的局部甲床組織予4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm厚的切片，按試劑盒要求使用末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)脫氧尿苷三磷酸（TUNEL）法標(biāo)記凋亡細(xì)胞。每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性染色細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（%）=（陽(yáng)性染色細(xì)胞/整個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血不同時(shí)間再灌注后甲床組織SOD活性的動(dòng)態(tài)變化

與對(duì)照組比較，甲床組織缺血30 min后再灌注，SOD活力無(wú)顯著改變（P>0.05），缺血 60、90、120 min 后再灌注其SOD活力顯著降低（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 缺血不同時(shí)間再灌注后甲床組織TNF-αmRNA表達(dá)的變化

與對(duì)照組比較，甲床組織缺血30 min后再灌注，TNF-α mRNA的表達(dá)無(wú)顯著改變 （P>0.05），缺血60 min后再灌TNF-α mRNA的表達(dá)顯著增加（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 缺血不同時(shí)間再灌注后甲床組織細(xì)胞凋亡的變化

與對(duì)照組比較，甲床組織缺血30 min后再灌注，細(xì)胞的凋亡率無(wú)顯著改變（P>0.05），缺血60 min后再灌注細(xì)胞的凋亡率隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而相應(yīng)的增加（P<0.01），但缺血90 min后細(xì)胞的凋亡率不再增加，與缺血120 min后再灌注比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

表1 缺血不同時(shí)間再灌注后甲床組織超氧化物歧化酶活性、腫瘤壞死因子-α mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡的變化（）

表1 缺血不同時(shí)間再灌注后甲床組織超氧化物歧化酶活性、腫瘤壞死因子-α mRNA表達(dá)、細(xì)胞凋亡的變化（）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與缺血再灌注60 min比較，▲P<0.01

檢測(cè)指標(biāo) 對(duì)照組 缺血時(shí)間30 min 60 min 90 min 120 min SOD活性（U/mg）TNF-α mRNA細(xì)胞凋亡率（%）11.05±2.1712.67±1.515.44±1.31*5.22±1.34*5.52±1.04*22.41±3.622.31±1.2222.74±1.243.44±2.0116.21±3.10*12.27±2.54*14.67±2.33*21.66±2.14*▲13.04±3.12*20.78±1.87*▲

3 討論

人類甲床和指甲不僅具有美觀的功能，而且具有手指的抓、捏、持、拿等穩(wěn)定功能，所以手指外傷后指甲的外觀及功能恢復(fù)十分重要。臨床工作中發(fā)現(xiàn)：一方面很多甲床損傷患者術(shù)后并發(fā)指甲畸形；另一方面上臂正常使用止血帶后，未受傷手指也出現(xiàn)指甲生長(zhǎng)畸形，其機(jī)制筆者考慮可能是缺血-再灌注損傷所致[3]。

缺血-再灌注損傷是指組織器官在缺血一定程度和時(shí)間后再重新恢復(fù)血供，不僅不能使組織恢復(fù)正常的代謝功能，反而會(huì)加重?fù)p傷，甚至使病情更加嚴(yán)重的一種病理生理現(xiàn)象[4]。缺血-再灌注損傷中氧自由基的產(chǎn)生是最主要的損傷因素，其不僅直接損傷再灌注的細(xì)胞，而且還會(huì)激發(fā)一系列的炎性反應(yīng)。SOD可以高效的清除氧自由基[5]，而筆者的研究顯示缺血再灌注后甲床組織中的SOD顯著減少。TNF-α也是體內(nèi)一個(gè)重要的炎癥因子，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其表達(dá)的升高可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)還可以誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重?fù)p傷[6]。筆者的研究也顯示了甲床組織缺血再灌注后TNF-α mRNA的表達(dá)顯著升高（P<0.01），并且甲床組織細(xì)胞的凋亡率也相應(yīng)的升高。有研究提示，在手外傷手術(shù)松止血帶后可以使用一些氧自由基清除劑來(lái)預(yù)防甲床組織凋亡的發(fā)生，或者缺血預(yù)處理較少相關(guān)炎癥因子的產(chǎn)生來(lái)達(dá)到預(yù)防術(shù)后指甲畸形的發(fā)生。筆者的研究顯示甲床組織缺血30 min后再灌注SOD活力、TNF-α mRNA表達(dá)和細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著改變（P>0.05），說(shuō)明短暫的缺血再灌注不會(huì)導(dǎo)致甲床的損傷，所以嚴(yán)格控制止血帶的時(shí)間是預(yù)防術(shù)后指甲畸形的一個(gè)有效方法。

綜上所述，本研究顯示缺血60 min后再灌注可以誘發(fā)甲床細(xì)胞凋亡的發(fā)生，SOD的減少和TNF-α表達(dá)的升高是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因。甲床損傷患者術(shù)后并發(fā)指甲畸形一方面是由于甲床自身?yè)p傷，另一方面可能是缺血-再灌注損傷所致。而上臂正常使用止血帶后，未受傷手指也出現(xiàn)指甲生長(zhǎng)畸形，其原因可能是由缺血-再灌注直接損傷所致。

[1]楊養(yǎng)賢，延衛(wèi)東，喬晉，等.黃芩對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦組織超氧化物歧化酶和丙二醛的影響[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004，8（28）：6146-6147.

[2]李軍，王朝陽(yáng).復(fù)方丹參滴丸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13（9）：199-120.

[3]肖海濤，岑瑛，陳衛(wèi)鑫，等.以指動(dòng)脈分支血管為蒂指?jìng)?cè)方皮瓣修復(fù)手指甲床缺損[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2011，25(9)：1140-1142.

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[6]張陽(yáng)，周輝，張燕，等.三種不同組織移植方法一期修復(fù)外傷性甲床缺損：40例51指甲床的隨訪比較[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（8）：3385-3388.