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產(chǎn)二甲苯單加氧酶菌株的篩選、鑒定及轉(zhuǎn)化2,5-二甲基吡嗪條件的優(yōu)化

2012-07-28 06:16:00劉麗娟薛亞平鄭裕國
化學與生物工程 2012年9期
關(guān)鍵詞:對二甲苯吡嗪二甲基

劉麗娟,薛亞平,鄭裕國

(浙江工業(yè)大學生物與環(huán)境工程學院,浙江 杭州 310014)

5-甲基吡嗪-2-羧酸是一種重要的醫(yī)藥中間體,可用于合成第二代口服降血糖藥物格列吡嗪(Glypizide)、新型抗高血壓藥物阿西莫司(Acipimox)、抗結(jié)核藥物5-甲基吡嗪-2-羧酸甲酯等。目前,5-甲基吡嗪-2-羧酸工業(yè)生產(chǎn)方法有化學合成法和生物合成法,其中化學合成法存在過程復雜、選擇性差、產(chǎn)率低、產(chǎn)物難分離、污染嚴重等缺點[1~8],而生物合成法因具有高效、高選擇性、條件溫和、環(huán)境友好等特點,近年來得到快速發(fā)展。研究表明,單加氧酶可以對吡嗪等雜環(huán)類化合物進行高效、高區(qū)域性的加氧反應(yīng)。研究者陸續(xù)篩選出Ralstonia/Burkholderiasp.DSM6920[9]、RhodococcuserythropolisDP-45[10]、Pseudomonasputida[11,12]等具有單加氧酶活性的菌株,其中惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)能夠選擇性地將2,5-二甲基吡嗪對稱甲基中的一個甲基氧化為羧基[11],且具有很強區(qū)域選擇性,在5-甲基吡嗪-2-羧酸的生產(chǎn)中應(yīng)用潛力巨大。瑞士的Lonza公司利用含二甲苯單加氧酶的菌株在批次補料反應(yīng)器中實現(xiàn)了5-甲基吡嗪-2-羧酸的微生物法生產(chǎn)[13]。目前,國內(nèi)還未見這方面的研究和報道。

作者從土壤中篩選出一株產(chǎn)二甲苯單加氧酶菌株,可以有效地將2,5-二甲基吡嗪氧化為5-甲基吡嗪-2-羧酸,對其進行生理生化鑒定及16S rDNA分析,并對轉(zhuǎn)化條件進行了優(yōu)化。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

從化工廠的排污口附近、菜園、果園、植物叢等處采集100余份土樣用以菌種篩選。

Biolog(GEN Ⅲ)微生物自動鑒定專用試劑及培養(yǎng)基等,Biolog公司;基因組DNA快速提取試劑盒,MP Bio公司;DNA純化試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒,Axygen公司。其它試劑均購自Sigma公司。

VFD-M型搖床,樂山長征制藥有限公司;LC-10AS型高效液相色譜儀,日本島津公司;XL30型環(huán)境掃描電鏡,荷蘭Philips公司;PTC200型擴增儀,美國Bio-Rad公司。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

菌種保藏培養(yǎng)基(g·L-1):酵母膏5,蛋白胨10,NaCl 5,瓊脂 20,pH值7.0。

種子液培養(yǎng)基(g·L-1):酵母膏 5,蛋白胨 10,NaCl 5,pH值7.0。

無機鹽培養(yǎng)基:先配好A、B、C 3種母液,然后按A∶B∶C∶蒸餾水=10∶2.5∶0.1∶87.4(體積比)混合均勻后高壓蒸汽滅菌。A(g·L-1):(NH4)2SO420,Na2HPO4·2H2O 25,KH2PO410,NaCl 30;B(g·L-1):MgCl2·6H2O 16,CaCl2·2H2O 0.58,F(xiàn)eCl3·6H2O 0.032;C(g·L-1):ZnSO4·7H2O 0.1,MnCl2·4H2O 0.09,H3BO30.3,CoCl2·6H2O 0.2,CuCl2·2H2O 0.01,NiCl2·6H2O 0.02,Na2MoO4·2H2O 0.03,EDTA·Na2·2H2O 5.0,F(xiàn)eSO4·7H2O 2.0,pH值7.0。

富集培養(yǎng)與發(fā)酵培養(yǎng)方法:在500 mL搖瓶中加入100 mL無機鹽培養(yǎng)基,將對二甲苯加入搖瓶中間的小管中,以蒸發(fā)出來的對二甲苯蒸汽為碳源(圖1),置于150 r·min-1、30 ℃的搖床上進行培養(yǎng)。

圖1 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)示意圖

1.3 菌株篩選及鑒定

1.3.1 菌株篩選

取約1 g土樣進行富集培養(yǎng),置于150 r·min-1、30 ℃的搖床上富集2次,每次2 d。然后將稀釋菌液涂布于平板的菌種保藏培養(yǎng)基上,待1~2 d長出單菌落后,挑取不同形態(tài)單菌落接種到菌種保藏培養(yǎng)基上于4 ℃冰箱保存。將初篩得到的菌株接種至搖瓶進行發(fā)酵培養(yǎng)(搖瓶中間的小管子加入1 mL的對二甲苯,對二甲苯作為唯一碳源保證菌體生長,同時可誘導二甲苯單加氧酶產(chǎn)生),培養(yǎng)12 h后加入100 μL 2,5-二甲基吡嗪。培養(yǎng)2 d后,取樣離心,過膜處理后用高效液相色譜檢測。選擇有催化活性的菌株,取轉(zhuǎn)化活性最高的菌株ZJB-LLJ進行鑒定及搖瓶轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化實驗。

1.3.2 生理生化鑒定

利用Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)對菌株ZJB-LLJ進行94種表型測試,包括71種碳源利用情況檢測以及23種化學敏感性檢測:將菌株接種于BUG平板培養(yǎng)基,33 ℃恒溫培養(yǎng)2 d,用無菌棉簽將平板上的菌體洗下,與接種液(IF-A)混合,制成菌懸液,用濁度計調(diào)整至95%T。用8孔電動加液器將菌懸液分別加入微孔鑒定板的各孔中,每孔100 μL。將微孔鑒定板放在33 ℃培養(yǎng)箱中,分別在培養(yǎng)12 h和24 h后將其置于Biolog讀數(shù)儀上讀取結(jié)果。

1.3.3 遺傳學鑒定

以提取到的細胞總DNA為模板,利用設(shè)計一對引物(p16S-8:5′-AGA GTTT GAT CCT GGC TCA G-3′及p16S-1541:5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′)擴增菌株ZJB-LLJ的16S rDNA序列,將PCR產(chǎn)物進行0.9%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.4 轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

1.4.1 轉(zhuǎn)化進程實驗

從斜面上挑取一環(huán)菌體接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)(500 mL搖瓶裝液量為100 mL、30 ℃、150 r·min-1,以下沒有特別說明均為此條件)。0~12 h,每2 h取樣一次;12~36 h,每4 h取樣一次。采用比濁法測菌懸液650 nm處的吸光度以確定其生物量。

以5%的接種量將12 h的種子液接入已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中(搖瓶小管中加入1 mL對二甲苯)培養(yǎng),培養(yǎng)12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪200 μL。整個培養(yǎng)過程每4 h取樣一次直到60 h。

1.4.2 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

以5%的接種量接種12 h的種子液到發(fā)酵培養(yǎng)基中(搖瓶小管中加入1 mL對二甲苯),置于30 ℃搖床中培養(yǎng)12 h后,加入底物2,5-二甲基吡嗪200 μL(100 μL對應(yīng)底物濃度為1 g·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每12 h取樣一次。用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值7~8保持恒定。

固定其它條件不變,考察碳源(二甲苯、對二甲苯、間二甲苯、鄰二甲苯)、底物加入時間(0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h)、溫度(20 ℃、30 ℃、40 ℃)、發(fā)酵培養(yǎng)基pH值(6、7、8、9、10)、初始底物濃度(1 g·L-1、2 g·L-1、3 g·L-1、4 g·L-1、5 g·L-1、6 g·L-1、7 g·L-1、8 g·L-1、9 g·L-1、10 g·L-1)對產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響。其中考察pH值影響時取樣時間調(diào)整為培養(yǎng)6 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、60 h;考察初始底物濃度時:1~5 g·L-1每12 h取樣一次直到120 h;6~10 g·L-1每24 h取樣一次直到312 h。

最后考察分批流加的影響:按上述方法培養(yǎng)12 h加入100 μL 2,5-二甲基吡嗪之后,每12 h流加100 μL 2,5-二甲基吡嗪直到144 h,之后每24 h流加100 μL 2,5-二甲基吡嗪直到480 h。每次加底物前取樣一次并調(diào)節(jié)pH值在7~8之間。培養(yǎng)至528 h再取樣一次。

1.5 分析與檢測

先測樣品OD650值及pH值,然后12 000 r·min-1離心6 min,取上清過膜處理后用高效液相色譜檢測。色譜條件為:ODS C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,大連依利特);流動相為乙腈-水(3∶7,體積比),流速1.0 mL·min-1,紫外檢測波長275 nm,進樣量10 μL,柱溫40 ℃。轉(zhuǎn)化液經(jīng)過減壓蒸餾,然后冷藏降溫,用濃鹽酸酸析得部分產(chǎn)物,酸析完的母液用戊酮萃取,萃取液減壓蒸餾得部分產(chǎn)物,進行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選

實驗初篩得到85株菌,復篩得到3株可以將2,5-二甲基吡嗪選擇性氧化為5-甲基吡嗪-2-羧酸的菌株,從中選出一株氧化活性最強的菌株ZJB-LLJ,菌落形態(tài)較小(圖2a),無褶皺,圓形,邊緣光滑,有光澤,乳黃色,半透明。掃描電鏡觀察細胞呈橢球形,長約0.8 μm,直徑約0.4 μm(圖2b)。

圖2 菌株ZJB-LLJ單菌落形態(tài)(a)和掃描電鏡下的形態(tài)(b)

2.2 菌株ZJB-LLJ的生理生化鑒定結(jié)果(表1、表2)

表1 菌株ZJB-LLJ對Biolog GEN Ⅲ板上71種碳源的利用能力

表2 菌株ZJB-LLJ對Biolog GEN Ⅲ板上23種化學物質(zhì)的化學敏感性

由表1可知,菌株ZJB-LLJ可較強利用27種碳源,對蔗糖等44種碳源不能利用或利用能力較弱。由表2可知,菌株ZJB-LLJ在pH值低于5、NaCl濃度高于4%下不能生長,另外對梭鏈孢酸等15種化學物質(zhì)敏感。Biolog系統(tǒng)鑒定菌株ZJB-LLJ為Pseudomonasputida。

2.3 菌株ZJB-LLJ的遺傳學鑒定

2.3.1 16S rDNA序列擴增

經(jīng)PCR擴增成功獲得了長約為1.5 kb的片段,將經(jīng)PCR擴增的片段克隆到pMD18-T(TaKaRa)、抽提質(zhì)粒后的含有本實驗獲得的16S rDNA片段的重組質(zhì)粒,經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序得到16S rDNA全序列,長度為1529 bp,該序列在GenBank上的登錄號為JQ824856。

2.3.2 菌種屬種的確定

測得的基因序列通過Blast 程序與GenBank 中的核酸數(shù)據(jù)庫進行對比分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast),測得的16S rDNA 全序列用CLUSTAL W ver.1.81A 軟件包進行排序[14],利用MEGA version 2.1[15]軟件包中的Kimura2-Parameter Distance模型計算進化距離,再用Neighour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,1000次隨機抽樣,計算自引導值(Bootstrap),以評估系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度。結(jié)果見圖3。

圖3 基于16S rDNA的菌株ZJB-LLJ系統(tǒng)進化樹

由圖3可知,微生物ZJB-LLJ與Pseudomonasputida的遺傳距離最小,同源性達99%,由此可以確定該菌株為Pseudomonasputida,中文名稱為惡臭假單胞菌,該結(jié)果與Biolog的鑒定結(jié)果相吻合。該菌種已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為CCTCC M 2011395。

2.4 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.4.1 底物與產(chǎn)物的高效液相色譜分析和質(zhì)譜分析

2,5-二甲基吡嗪與5-甲基吡嗪-2-羧酸的標準品和發(fā)酵轉(zhuǎn)化液的液相色譜見圖4。

圖4 2,5-二甲基吡嗪與5-甲基吡嗪-2-羧酸的液相色譜圖

由圖4可知,標準品和發(fā)酵轉(zhuǎn)化液的保留時間一致。

發(fā)酵轉(zhuǎn)化液經(jīng)質(zhì)譜分析,ESI-MS,m/z:139(M+1),與5-甲基吡嗪-2-羧酸分子量一致。

2.4.2 轉(zhuǎn)化進程

測得菌株ZJB-LLJ轉(zhuǎn)化2,5-二甲基吡嗪為5-甲基吡嗪-2-羧酸的過程曲線見圖5。

圖5 菌株ZJB-LLJ轉(zhuǎn)化2,5-二甲基吡嗪為5-甲基吡嗪-2-羧酸的過程曲線

由圖5可知,菌株從5 h開始進入對數(shù)生長期,12 h后進入穩(wěn)定期,因此后續(xù)的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)選擇12 h的種子液。轉(zhuǎn)化過程中,菌體量不斷增加,培養(yǎng)60 h時OD650最大,為0.48。培養(yǎng)12 h后加入底物2,5-二甲基吡嗪,底物濃度由1.71 g·L-1逐漸減小,培養(yǎng)44 h時出現(xiàn)最小值0.69 g·L-1;同時產(chǎn)物5-甲基吡嗪-2-羧酸濃度逐漸增大,44 h后達到0.65 g·L-1,接近最大值,由此,可選擇48 h取樣。pH值由6.8逐漸減小,52 h時達到最小值5.2,之后又有所回升,這可能是因為菌種生長進入衰亡期釋放出堿性物質(zhì)。

2.4.3 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.4.3.1 碳源(圖6)

圖6 不同碳源對產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖6可知,二甲苯、對二甲苯、間二甲苯為碳源及誘導劑的產(chǎn)物產(chǎn)生趨勢基本一樣,培養(yǎng)60 h時產(chǎn)物濃度達到最高,分別為0.52 g·L-1、0.50 g·L-1和0.49 g·L-1,但加對二甲苯前12 h產(chǎn)物積累的速度明顯要快。而加鄰二甲苯的整個過程沒有產(chǎn)物積累。另外,對二甲苯的價格及毒性較低,綜合考慮,選擇對二甲苯為碳源,并誘導單加氧酶的產(chǎn)生。

2.4.3.2 底物加入時間(圖7)

圖7 底物加入時間對產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖7可知,0 h即轉(zhuǎn)接完種子液后立即加入底物的產(chǎn)物濃度為0.24 g·L-1;12 h之前,隨著底物加入時間的延長,產(chǎn)物濃度逐漸增大;12 h時加入底物,產(chǎn)物濃度最大,為0.63 g·L-1;此后隨著底物加入時間的繼續(xù)延長,產(chǎn)物濃度開始減小。因此,選擇底物加入時間為12 h。

2.4.3.3 培養(yǎng)溫度(圖8)

圖8 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖8可知,反應(yīng)12 h時30 ℃與40 ℃的產(chǎn)物濃度都大于0.21 g·L-1,20 ℃的產(chǎn)物濃度較低,為0.08 g·L-1;30 ℃的產(chǎn)物積累速度明顯高于20 ℃與40 ℃,在60 h時產(chǎn)物濃度達到最大值1.89 g·L-1,遠遠高于20 ℃和40 ℃的最大產(chǎn)物濃度。因此,選擇培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.4.3.4 pH值(圖9)

圖9 pH值對產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

由圖9可知,pH值為8時整個轉(zhuǎn)化過程的產(chǎn)物積累量都為最大,pH值為7、 8、 9的最終產(chǎn)物濃度均達到1.41 g·L-1左右,pH值為6、10的最終產(chǎn)物濃度較低,分別為1.18 g·L-1、0.55 g·L-1。這說明中性偏堿性的轉(zhuǎn)化環(huán)境最適合產(chǎn)物的積累。

2.4.3.5 初始底物濃度(圖10)

由圖10可知,初始底物濃度越大,反應(yīng)速度越慢??赡艽嬖谝欢ǖ牡孜镆种?。初始底物濃度為1 g·L-1、2 g·L-1、3 g·L-1、4 g·L-1、5 g·L-1、6 g·L-1、7 g·L-1時,反應(yīng)分別在36 h、48 h、120 h、120 h、120 h、240 h、240 h時基本完全,最終產(chǎn)物濃度分別為1.02 g·L-1、1.56 g·L-1、2.02 g·L-1、2.41 g·L-1、2.52 g·L-1、6.35 g·L-1、6.53 g·L-1;初始底物濃度為8 g·L-1、9 g·L-1、10 g·L-1時,在最后312 h取樣的產(chǎn)物濃度分別達到7.42 g·L-1、7.05 g·L-1、6.00 g·L-1,但并未達到最大值,考慮轉(zhuǎn)化時間太長沒有繼續(xù)取樣。從圖10還可知,初始底物濃度過大時,開始階段的底物抑制較強烈,隨著反應(yīng)的進行,產(chǎn)物生成速率顯著加快,且菌株度過抑制期后,隨著初始底物濃度的增大,產(chǎn)物積累速率也明顯提高。這表明,菌株對環(huán)境有一定的適應(yīng)能力,當菌株適應(yīng)了高濃度底物的環(huán)境后,就可以快速對底物進行氧化,且氧化速率隨著底物初始濃度的增大而加快。

圖10 初始底物濃度對產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的影響

2.4.3.6 分批流加

考慮到初始底物濃度過大會有相當長的抑制期,而初始底物濃度過小時,產(chǎn)物積累量又較少,采用分批流加的方式來生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸,結(jié)果見圖11。

圖11 分批流加生產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸

由圖11可知,采用流加方式,相比一開始就加高濃度的底物,積累5-甲基吡嗪-2-羧酸的速率可以一直保持在3.80 mg·h-1以上,反應(yīng)528 h時取樣,產(chǎn)物濃度達20.41 g·L-1,產(chǎn)率達到75.6%。

3 結(jié)論

從土壤中篩選得到一株可以選擇性氧化2,5-二甲基吡嗪生成5-甲基吡嗪-2-羧酸的產(chǎn)單加氧酶菌株ZJB-LLJ,經(jīng)過生理生化鑒定及16S rDNA序列分析確定為惡臭假單胞菌。并對其轉(zhuǎn)化2,5-二甲基吡嗪產(chǎn)5-甲基吡嗪-2-羧酸的條件進行了優(yōu)化,結(jié)果表明在500 mL搖瓶中裝液100 mL、溫度為30 ℃、pH值為7~8、以對二甲苯為唯一碳源、誘導培養(yǎng)12 h后添加底物的條件下,產(chǎn)物積累量最大;采用分批流加的方式積累產(chǎn)物較快,轉(zhuǎn)化528 h后5-甲基吡嗪-2-羧酸濃度達20.41 g·L-1,產(chǎn)率達到75.6%。菌株ZJB-LLJ可以有效地將2,5-二甲基吡嗪氧化成5-甲基吡嗪-2-羧酸,具有區(qū)域選擇性高、反應(yīng)條件溫和、轉(zhuǎn)化率較高等優(yōu)點,如經(jīng)過進一步發(fā)酵罐優(yōu)化后,有望達到工業(yè)生產(chǎn)的要求。

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吡嗪-2,3,5,6-四甲酸及4,4′-聯(lián)吡啶與ds-金屬配合物合成、結(jié)構(gòu)及發(fā)光性質(zhì)
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