梁利華，董 霞

(石藥集團(tuán)維生藥業(yè)(石家莊)有限公司，河北 石家莊 050035)

石油煉廠污水處理系統(tǒng)和石油儲運(yùn)系統(tǒng)會產(chǎn)生大量的煉油污泥(簡稱油泥)。常見的生物處理方法有：土地耕作法[1]和生物堆肥法[2]。溫度、油本身的組分、外源營養(yǎng)物質(zhì)、油污的物理狀態(tài)等是影響微生物降解能力的主要因素[3]。不同微生物對原油中烴類化合物的代謝途徑和機(jī)理不同，目前對原油烴的微生物降解研究多為以下3個方面：篩選和馴化優(yōu)良降解菌種[4，5]；原油降解特性的研究[6]；微生物治理原油污染的應(yīng)用研究[7]。作者篩選出高效穩(wěn)定降解油泥的菌株，優(yōu)化其實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件，初步探討了該菌在實(shí)驗(yàn)室條件下處理煉廠油泥的效果，為其進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)用土樣采自鉆井機(jī)周邊土壤和某煉廠廠內(nèi)土壤，泥樣采自某煉廠污水處理站活性污泥、污水處理站處理后污泥。

(1)基礎(chǔ)無機(jī)鹽溶液(g)：NaCl 0.5，(NH4)2SO40.1，NaNO30.2，KH2PO40.4，K2HPO4·3H2O 1.0，蒸餾水 100 mL。

(2)原油液體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)無機(jī)鹽溶液100 mL，原油(勝利原油，下同)2.0 g，pH值自然。

(3)原油固體選擇性培養(yǎng)基：基礎(chǔ)無機(jī)鹽溶液 100 mL，原油2.0 g，酵母膏0.1 g，瓊脂1.5 g，pH值自然。

(4)葡萄糖液體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)無機(jī)鹽溶液100 mL，酵母膏0.1 g，20%葡萄糖溶液5.0 mL，pH值自然。

(5)LB液體培養(yǎng)基。

(6)油泥培養(yǎng)基：油泥5.0 g，優(yōu)化的無機(jī)鹽溶液50.0 mL，pH值自然。

1.2 菌株篩選

1.2.1 初篩

將采集到的樣品加入到原油液體培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)7 d。取降解現(xiàn)象明顯的培養(yǎng)基，在原油固體選擇性培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離，30 ℃下培養(yǎng)4～5 d。從降油斑附近挑取單菌落到葡萄糖液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)24 h,再次劃線，分離保存。

1.2.2 復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種到葡萄糖液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1、30 ℃下培養(yǎng)24 h。吸取10 mL菌液加入到原油液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1下培養(yǎng)7 d。用紫外分光光度法測其含油量。將篩選出的高效降油菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1下培養(yǎng)，用分光光度法測定菌體生長量。

1.2.3 菌株生理生化特性

對所篩選出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、淀粉水解、明膠液化、糖或醇發(fā)酵、甲基紅(MR)、乙酰甲基醇(VP)、吲哚、硫化氫產(chǎn)生等生理生化實(shí)驗(yàn)。

1.3 溫度、pH值、葡萄糖及無機(jī)鹽濃度對降解菌T1生長的影響

將經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后的菌株T1，按5%的接種量接種到121 ℃滅菌20 min的葡萄糖液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20 h，測量菌體生長的OD600值?？疾鞙囟?20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、pH值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、葡萄糖濃度(g·L-1)(10、15、20、25、30)、無機(jī)鹽濃度(g·L-1)[NaCl為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0；(NH4)2SO4為0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8；NaNO3為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0；KH2PO4為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0；K2HPO4·3H2O為5.0、10.0、15.0、20.0、25.0]對菌株生長的影響。

1.4 無機(jī)鹽對菌株T1降解油泥的影響

1.5 降解菌對油泥的降解效果

在油泥培養(yǎng)基中考察篩選菌株對油泥的降解效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離純化

分離得到純化菌株8株，其中4株原油降解率在60%以下；3株原油降解率在60%～70%之間；1株原油降解率在70%以上。圖1為3株原油降解率較高菌(T1、A2、Z8)的降解效果，其中菌株T1對原油的降解效果最好，降解率為17.9%。

圖1 篩選的3株菌對原油的降解率

2.2 菌株生理生化特性(表1)

從表1可知，根據(jù)菌株形態(tài)及生理生化特征，初步鑒定菌株T1為芽孢桿菌屬。

2.3 降解菌T1的生長曲線

選定降油效果最好的菌株T1測定其生長曲線，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，在0～16 h期間，菌株大量繁殖，處于對數(shù)生長期；在16～42 h期間，生長量變化不大，處于穩(wěn)定期；在42 h之后，生長量減少，菌體生長進(jìn)入衰亡期。因此，選擇菌液的發(fā)酵時間為20 h。

表1 菌株初步鑒定結(jié)果

圖2 菌株T1的生長曲線

2.4 溫度、pH值、葡萄糖及無機(jī)鹽濃度對降解菌T1生長的影響(圖3、圖4)

圖3 溫度、pH值、葡萄糖濃度對T1生長的影響

圖4 無機(jī)鹽濃度對T1生長的影響

對圖3進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)溫度和pH值對菌株T1生長的影響較大，這一結(jié)論和其它降油菌的研究相似[8]。

對圖4進(jìn)行分析，各無機(jī)鹽中，K2HPO4·3H2O對菌株生長影響最大，K2HPO4在補(bǔ)充磷源的同時使培養(yǎng)基的pH值緩沖在偏堿性條件，有利于菌株的生長。得到降解菌T1的最佳培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基組成為：溫度30 ℃，pH值9.0，葡萄糖25 g·L-1，NaCl 3.0 g·L-1,(NH4)2SO41.0 g·L-1，NaNO31.0 g·L-1，KH2PO44.0 g·L-1，K2HPO4·3H2O 25.0 g·L-1。

2.5 無機(jī)鹽對菌株T1降解油泥的影響

無機(jī)鹽組分正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的極差分析見圖5。

圖5 無機(jī)鹽組分正交實(shí)驗(yàn)極差分析

由圖5可以看出，無機(jī)鹽組分對油泥降解的影響大小依次為：K2HPO4·3H2O>KH2PO4>NaNO3>NaCl>(NH4)2SO4。其中，KH2PO4、NaNO3、NaCl三者的極差非常接近，對油泥降解的影響差別不大。磷酸鹽K2HPO4·3H2O和KH2PO4都能作為磷源的補(bǔ)充，但是K2HPO4·3H2O與KH2PO4相比，在調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值上具有優(yōu)勢，能使培養(yǎng)基維持堿性，因此K2HPO4·3H2O比KH2PO4對油泥降解影響更大一些。

2.6 篩選菌株對油泥的降解(圖6)

圖6 篩選菌株對油泥的降解效果

由圖6可以看出，T1、A2、Z8 3株菌對油泥的降解效果較好，油泥中原油的降解率均在60%以上，其中菌株T1的降解率為71.3%，相比對原油的降解效果有所下降，這是因?yàn)榫w所處的環(huán)境有所改變，油類的組成不同而造成的。需要對菌株進(jìn)行進(jìn)一步的馴化。

3 結(jié)論

篩選到了3株降解煉廠油泥中原油效果較好的菌株T1、A2、Z8，其中菌株T1的降解效果最好。菌株T1的最佳培養(yǎng)條件為：溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速160 r·min-1、pH值9.0；最佳的培養(yǎng)基組成(g·L-1)為：葡萄糖25、NaCl 3.0、(NH4)2SO41.0、NaNO31.0、KH2PO44.0、K2HPO4·3H2O 25.0。雖然一代菌株對煉廠油泥的原油降解效果較為理想，但菌種傳代后，降油能力有退化的現(xiàn)象。應(yīng)尋求更加合適的手段保持菌種的降解活性，并進(jìn)一步深入研究該菌對原油的降解過程以及降解機(jī)理。

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