陳 莉，張少博，黃 典，邵宗澤，孫風(fēng)芹，王雪飛，喻子牛，張吉斌

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室 微生物農(nóng)藥國家工程研究中心，湖北 武漢 430070；2.國家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遺傳資源重點實驗室，福建 廈門 361005)

海洋微生物資源極其豐富。近年來，由于研究者對海洋生物研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)了越來越多的來源于海洋微生物的生物活性物質(zhì)。這些海洋源活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)新穎、種類繁多，成為新藥開發(fā)的重要來源之一。此外，海洋源微生物的活性物質(zhì)在化工、食品甚至農(nóng)藥等領(lǐng)域也都有著廣闊的應(yīng)用前景，已經(jīng)成為海洋資源開發(fā)的重要內(nèi)容之一[1]。國外很早就開始了海洋源微生物藥物的開發(fā)研究，并已經(jīng)取得了許多引人注目的成果，但海洋源微生物農(nóng)藥領(lǐng)域的研究才剛剛開始，我們應(yīng)該抓住這一有利時機大力發(fā)展我國海洋源微生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)。

水稻白葉枯病是由水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)引起的，最早于1884年在日本福岡地區(qū)發(fā)現(xiàn)，后隨種子調(diào)運，病區(qū)不斷擴大，其中中國、日本和印度發(fā)生比較嚴(yán)重。1944年Waksman從灰色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了鏈霉素，對水稻白葉枯病有很好的防治效果[2]。目前國內(nèi)外主要還是利用陸地微生物來進行水稻白葉枯病的防治。

枝芽孢桿菌屬(Virgibacillussp.)的前身為泛酸芽孢桿菌屬(Bacilluspantothenticussp.)，是1998年Heyndrickx等通過rDNA擴增片段限制性內(nèi)切酶和生理生化鑒定等方法來確定分類的[3]。近幾年，陸續(xù)有一些新分離的海洋枝芽孢桿菌被報道，例如中國南海硇洲島附近水域分離得到的Virgibacilluszhanjiangensissp.nov.[4]，韓國黃海海域分離得到的Virgibacillusbyunsanensissp.nov.[5]和Virgibacilluscampisalissp.nov.[6]等。運用海洋來源尤其是深海來源的枝芽孢桿菌進行生物防治目前還未見報道，隨著該屬菌株類型的逐漸增多，未來很有可能成為海洋活性物質(zhì)研究的熱點。

作者以深海獨島枝芽孢桿菌A493為研究對象，研究了其產(chǎn)活性物質(zhì)特性及發(fā)酵條件的優(yōu)化，以期發(fā)現(xiàn)新型活性物質(zhì)并提高活性物質(zhì)的產(chǎn)量，為后續(xù)深入研究提供可靠的依據(jù)。

1 實驗

1.1 菌種與培養(yǎng)基

病原指示菌：水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)pxo99，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室菌種保藏中心(CCAM)提供。

海洋菌：海洋獨島枝芽孢桿菌A493(V.dokdonensisMCCC1A00493)，由國家海洋局第三海洋研究所海洋生物遺傳資源重點實驗室鑒定并提供。該菌分離自東太平洋多金屬結(jié)核區(qū)，采集深度4754 m，站點：ES0304。

海洋菌培養(yǎng)基(2216e)：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，牛肉浸粉1 g，乙酸鈉1 g，硝酸銨0.2 g，檸檬酸鈉0.5 g，檸檬酸鐵0.1 g，人工海水定容至1 L，pH=7.6±0.2。

水稻黃單胞菌培養(yǎng)基：馬鈴薯300 g，蔗糖15 g，Na2HPO4·12H2O 2 g，Ca(NO3)2·4H2O 0.5 g，蛋白胨5.0 g，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 A493產(chǎn)活性物質(zhì)特性研究

(1)遺傳穩(wěn)定性

海洋菌A493連續(xù)傳代10代，傳代間隔2 d。同時挑取每一代平皿生長的單菌落接液體培養(yǎng)基，于28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。以水稻黃單胞菌為指示菌采用牛津杯法檢測抑菌圈大小。重復(fù)3次。

(2)溫度處理

取A493發(fā)酵48 h的無菌上清液7份，分別在50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、121 ℃條件下處理60 min，冷卻至室溫25 ℃，檢測抑菌效果。重復(fù)3次。

(3)酸、堿處理

取無菌上清液7份，分別調(diào)pH值為2、4、6、8、9、10、12，室溫下處理3 h，然后復(fù)調(diào)到原始pH值9。以原始上清液為對照，檢測抑菌效果。重復(fù)3次。

(4)紫外線照射處理

取1 mL無菌上清液4份分別加至滅菌平皿中，形成一層很薄的水層。距紫外燈15 cm處各處理30 min、60 min、90 min、120 min。以原始上清液為對照，檢測抑菌效果。重復(fù)3次。

(5)蛋白酶處理

取蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶(終濃度均為1 mg·mL-1)分別處理無菌上清液3 h。蛋白酶K在pH值8.0、40 ℃處理；胰蛋白酶在pH值8.0、37 ℃處理；胃蛋白酶在pH值4.5、37 ℃處理。以原始上清液和終濃度為1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶為對照，檢測抑菌效果。重復(fù)3次。

(6)超濾處理

選用3 kDa、10 kDa、50 kDa、100 kDa再生纖維膜超濾管，取無菌上清液5 mL，先過100 kDa超濾管，取截留液以及濾過液分別測定活性；然后將100 kDa濾過液再經(jīng)過50 kDa超濾管，取截留液以及濾過液分別測定活性；同法依次經(jīng)過10 kDa、3 kDa超濾管過濾。以原始上清液為對照，測定抑菌活性并判斷活性物質(zhì)分子量范圍。

(7)有機溶劑溶解處理

取石油醚、異戊醇、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇分別與等體積無菌上清液混合萃取。分別取萃取相和萃余相濃縮處理。以原始上清液為對照，分別測定萃取液和萃余液的抑菌活性。

取4份20 mL的無菌上清液濃縮成固體粉末，分別用水、甲醇、乙醇、丙酮溶解，棄沉淀，濃縮干燥，用水定容至20 mL。以原始上清液為對照，檢測抑菌效果。

(8)酸沉淀和硫酸銨沉淀處理

酸沉淀：將無菌上清液用鹽酸調(diào)pH值至2.0，于4 ℃過夜處理。然后于8000 r·min-1、4 ℃離心30 min，上清液復(fù)調(diào)回原始pH值，沉淀用pH值9.0磷酸緩沖溶液溶解。以原始上清液為對照，測定抑菌活性。

硫酸銨沉淀：采用梯度鹽析法，分別檢測0～20%、20%～40%、40%～60%、60%～80%、80%～100%硫酸銨濃度梯度下沉淀以及上清液的活性。各濃度處理的無菌上清液4 ℃過夜處理。

1.2.2 A493發(fā)酵條件的初步優(yōu)化

1.2.2.1 發(fā)酵條件單因子實驗

挑選A493單菌落進行種子液搖瓶培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)12 h的種子液按照1%(體積比，下同)的接種量接種至250 mL搖瓶中，裝液量為70 mL，于28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)48 h，測定無菌上清液活性。

固定其它條件不變，分別考察接種菌齡(8 h、12 h、16 h、20 h、24 h)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、發(fā)酵時間(4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h、56 h、60 h)、發(fā)酵溫度(24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃)、裝液量(30 mL、50 mL、70 mL、90 mL、110 mL)、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速(120 r·min-1、140 r·min-1、160 r·min-1、180 r·min-1、200 r·min-1)對活性物質(zhì)產(chǎn)量(以抑菌圈直徑表示，抑菌圈直徑大，表示活性物質(zhì)產(chǎn)量高)的影響。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.2.2 抗菌活性與菌體生長的關(guān)系

根據(jù)確定的最佳條件發(fā)酵，分別取4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h、40 h、44 h、48 h、52 h、56 h、60 h發(fā)酵液各1 mL，檢測菌體生長(OD660)及活性物質(zhì)產(chǎn)生情況。OD660表示菌體量，以對水稻黃單胞菌抑菌圈大小表示活性物質(zhì)活性，繪制菌體量與抗菌活性的關(guān)系曲線。

1.2.2.3 活性物質(zhì)相對效價的測定

以標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素為對照。分別配制濃度為250.0 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、31.25 μg·mL-1、15.63 μg·mL-1、7.81 μg·mL-1、3.90 μg·mL-1、1.95 μg·mL-1的鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測不同濃度鏈霉素對水稻黃單胞菌的抑制效果。以各濃度抑菌圈直徑為橫坐標(biāo)、鏈霉素濃度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)等體積 A493發(fā)酵液對水稻黃單胞菌抑菌圈大小，確定A493產(chǎn)活性物質(zhì)的相對效價。

2 結(jié)果與討論

2.1 A493產(chǎn)活性物質(zhì)特性

2.1.1 遺傳穩(wěn)定性(圖1)

圖1 A493抑菌效果的遺傳穩(wěn)定性

從圖1可以看出，經(jīng)過10代連續(xù)培養(yǎng)，A493對水稻黃單胞菌的抑制效果無明顯變化，說明A493產(chǎn)活性物質(zhì)遺傳穩(wěn)定性較好。

2.1.2 對溫度的敏感性(表1)

表1 不同溫度處理后A493發(fā)酵液的抑菌效果

從表1可以看出，A493產(chǎn)活性物質(zhì)對溫度不敏感，100 ℃處理60 min后抑菌活性基本沒有變化，121 ℃處理60 min后才有所降低。表明該活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，在高溫下不容易失活。

2.1.3 對酸、堿的敏感性(圖2)

圖2 不同pH值處理后A493發(fā)酵液的抑菌效果

從圖2可以看出，發(fā)酵液的抑菌活性在pH值4～10之間都是穩(wěn)定的，但是過酸或過堿對其有一定的影響。說明A493產(chǎn)活性物質(zhì)對酸、堿穩(wěn)定性較好。

2.1.4 對紫外線的敏感性(圖3)

圖3 紫外線照射不同時間的A493發(fā)酵液的抑菌效果

從圖3可以看出，即使經(jīng)過長達2 h的紫外線照射，發(fā)酵液的抑菌活性仍未受影響。表明A493產(chǎn)活性物質(zhì)對紫外線耐受。

2.1.5 對蛋白酶的敏感性

將發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別處理后進行抑菌實驗發(fā)現(xiàn)，其抑菌活性未受到影響。說明A493產(chǎn)活性物質(zhì)對這3種蛋白酶不敏感。

2.1.6 分子量大小

取經(jīng)梯度超濾處理后的發(fā)酵液分別進行抗菌檢測，結(jié)果顯示A493產(chǎn)活性物質(zhì)可以通過3 kDa的超濾管，屬小分子物質(zhì)。

2.1.7 有機溶劑溶解性

萃取實驗結(jié)果表明，有機溶劑石油醚、異戊醇、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇均不能將活性物質(zhì)萃出，萃余相的活性物質(zhì)也不會因為有機溶劑處理而失活，對這些有機溶劑耐受。分別用水、甲醇、乙醇、丙酮溶解經(jīng)過干燥處理的無菌上清液粉末，充分溶解后進行抑菌實驗，結(jié)果顯示A493產(chǎn)活性物質(zhì)只能被水和甲醇溶解，是極性很強的物質(zhì)。

2.1.8 酸沉淀和硫酸銨沉淀處理結(jié)果

脂肽類物質(zhì)是芽孢桿菌產(chǎn)生的主要抗菌物質(zhì)，這類物質(zhì)可以經(jīng)酸沉淀或硫酸銨沉淀而析出。實驗發(fā)現(xiàn)，酸沉淀后雖有部分物質(zhì)析出，但上清液具有活性而沉淀物沒有活性，表明活性物質(zhì)不能被酸沉淀；而任何硫酸銨濃度下活性物質(zhì)均不被析出。由此可以初步判斷，A493產(chǎn)活性物質(zhì)不屬于脂肽類抗菌活性物質(zhì)。

2.2 A493發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵條件單因子實驗

2.2.1.1 接種菌齡對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響(圖4)

圖4 接種菌齡對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

從圖4可以看出，種子液菌齡對活性物質(zhì)產(chǎn)量影響較大，種子液菌齡為8 h時活性物質(zhì)產(chǎn)量最小，為12 h時活性物質(zhì)產(chǎn)量最高，為16～24 h時活性物質(zhì)產(chǎn)量又有所降低。所以選擇12 h為最佳接種菌齡。

2.2.1.2 接種量對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響(圖5)

圖5 接種量對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

從圖5可以看出，接種量對活性物質(zhì)產(chǎn)量影響較大。接種量為1%～3%時活性物質(zhì)產(chǎn)量較高，其中接種量為1%時活性物質(zhì)產(chǎn)量最高；隨著接種量的增加，活性物質(zhì)產(chǎn)量逐漸降低。所以選擇1%為最佳接種量。

2.2.1.3 發(fā)酵時間對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響(圖6)

圖6 發(fā)酵時間對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

從圖6可以看出，在發(fā)酵前12 h沒有活性物質(zhì)產(chǎn)生，從16 h開始活性物質(zhì)產(chǎn)量持續(xù)增加，至48 h時活性物質(zhì)產(chǎn)量達最大值，之后活性物質(zhì)產(chǎn)量下降。所以選擇48 h為最佳發(fā)酵時間。

2.2.1.4 發(fā)酵溫度對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響(圖7)

圖7 發(fā)酵溫度對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

從圖7可以看出，發(fā)酵溫度在24～34 ℃范圍內(nèi)，活性物質(zhì)產(chǎn)量幾乎沒有變化。表明A493產(chǎn)活性物質(zhì)在24～34 ℃范圍內(nèi)基本穩(wěn)定，不受溫度影響。這也說明了深海微生物可能具有更強的適應(yīng)能力。結(jié)合本實驗室需要，選擇28 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

2.2.1.5 裝液量對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響(圖8)

圖8 裝液量對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

從圖8可以看出，裝液量對活性物質(zhì)產(chǎn)量有一定的影響。裝液量在30～70 mL之間時活性物質(zhì)產(chǎn)量較高；隨著裝液量的提高，其產(chǎn)量逐漸降低。這可能是由于溶氧量的下降造成的。所以選擇70 mL為最佳裝液量。

2.2.1.6 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響(圖9)

圖9 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響

從圖9可以看出，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對活性物質(zhì)產(chǎn)量影響較小。轉(zhuǎn)速在160～180 r·min-1之間時活性物質(zhì)產(chǎn)量較高，轉(zhuǎn)速過低或過高時活性物質(zhì)產(chǎn)量均略有降低。這可能是由于，轉(zhuǎn)速過低時供氧量不足，轉(zhuǎn)速過高又產(chǎn)生過多泡沫而影響菌體生長。所以選擇180 r·min-1為最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

2.2.2 優(yōu)化條件的驗證

單因子實驗得到A493最佳發(fā)酵條件為：接種菌齡12 h、接種量1%、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度28 ℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r·min-1、250 mL錐形瓶中的裝液量為70 mL。驗證實驗結(jié)果表明所確定優(yōu)化發(fā)酵條件有效，抑菌圈直徑由原來的16.6 mm增大到19.7 mm，單位體積發(fā)酵液抑菌效果提高了18.7%。

2.2.3 抗菌活性與菌體生長的關(guān)系(圖10)

圖10 A493生長與其抗菌物質(zhì)活性的關(guān)系

從圖10可以看出，發(fā)酵前12 h內(nèi)沒有活性物質(zhì)產(chǎn)生，發(fā)酵48 h后活性物質(zhì)的活性達到最大，然后開始下降；A493在發(fā)酵8 h后進入對數(shù)生長期，28 h后進入穩(wěn)定生長期，48 h后進入衰亡期。這表明抑菌活性是在A493對數(shù)生長期開始出現(xiàn)，直到菌株穩(wěn)定生長期末期達到最大值，進入衰亡期后開始降低。

2.2.4 活性物質(zhì)相對效價的測定

根據(jù)鏈霉素產(chǎn)生的抑菌圈直徑和濃度對數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖11。

圖11 鏈霉素抑制水稻黃單胞菌標(biāo)準(zhǔn)曲線

在保證培養(yǎng)基濃度及厚度、指示菌濃度、A493發(fā)酵上清液和對照鏈霉素加樣量相同的前提下，經(jīng)過48 h培養(yǎng)后，精確測量A493發(fā)酵上清液所產(chǎn)生的抑菌圈與對照鏈霉素所產(chǎn)生的抑菌圈直徑。根據(jù)等體積A493發(fā)酵上清液對水稻黃單胞菌抑菌圈的大小和鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定A493發(fā)酵液中活性物質(zhì)的相對效價相當(dāng)于15.6 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素。

3 結(jié)論

以篩選得到的一株抗菌譜較窄并且穩(wěn)定拮抗水稻黃單胞菌的海洋獨島枝芽孢桿菌(V.dokdonensis)A493為研究對象，對其產(chǎn)活性物質(zhì)特性及發(fā)酵條件的優(yōu)化進行了研究。

(1)菌株A493有較高的遺傳穩(wěn)定性，所產(chǎn)活性物質(zhì)熱穩(wěn)定性強、在pH值4～10之間穩(wěn)定、對紫外線耐受、對蛋白酶不敏感、分子量小于3 kDa、只能溶于水和甲醇。酸沉淀和硫酸銨沉淀實驗結(jié)果，排除了活性物質(zhì)是脂肽類物質(zhì)的可能性，初步研究顯示該活性物質(zhì)可能是極性較強的水溶性小分子新化合物。

(2)菌株A493最佳發(fā)酵條件為：接種菌齡12 h、接種量1%、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度28 ℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180 r·min-1、250 mL錐形瓶中的裝液量為70 mL。優(yōu)化后，其單位體積發(fā)酵液抑菌效果提高了18.7%，活性物質(zhì)對水稻黃單胞菌的抑菌效價相當(dāng)于15.6 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)鏈霉素。

參考文獻：

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