黃 玉，趙 丹，李 毅,2

(1.華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079;2.武漢生物工程學(xué)院生物工程系，湖北 武漢 430415)

人細小病毒B19(Human parvovirus B19，簡稱B19)屬于細小病毒科紅細胞病毒屬，是澳大利亞病毒學(xué)家Yvonne Cossart在1975年從獻血者的血清中發(fā)現(xiàn)的[1]。B19主要侵襲人體骨骼造血系統(tǒng)，感染原紅細胞，通過阻止紅細胞的生成[2]而引起如傳染性紅斑、紅細胞再生障礙性貧血危象、關(guān)節(jié)病、孕婦流產(chǎn)、胎兒水腫和死胎等病癥。

和其它細小病毒一樣，B19也是無囊膜的DNA病毒，病毒粒子呈二十面體，直徑22～24 nm。病毒的基因組全長5596 bp，編碼2個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和1個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1[3]，在不同病毒株之間，NS1相對保守，VP1和VP2則有較大可變性[4]。

B19的2個結(jié)構(gòu)蛋白VP1(83 kDa)和VP2(58 kDa)的C端完全相同，只是VP1的N端比VP2多出227個氨基酸，該區(qū)域稱為VP1獨特區(qū)(VP1 unique，VP1u)[5]，VP1u對病毒的感染具有重要作用。

磷脂酶PLA2超家族主要包含分泌性PLA2(sPLA2)、細胞質(zhì)PLA2、不依賴Ca2+的PLA2、與脂蛋白相聯(lián)系的PLA2，分子量約13～15 kDa。在體內(nèi)，PLA2水解相應(yīng)底物產(chǎn)生的脂肪酸和溶血磷脂是重要的脂質(zhì)介導(dǎo)物和第二信使[6]，推測PLA2與炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化的形成有密切關(guān)系，因此，研究PLA2對治療相關(guān)疾病有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，很多細小病毒的VP1u具有分泌性磷脂酶PLA2(sPLA2)的活性，如腺相關(guān)病毒(AAV)[7]、豬細小病毒(PPV)[8]，人細小病毒B19也不例外，B19-VP1u的130～195位氨基酸為sPLA2活性的保守區(qū)[9]，突變其中的一個位點會降低酶活性和病毒感染性[10]。

然而，保守區(qū)外的氨基酸可能對VP1u形成正確的三維結(jié)構(gòu)起作用，也可能拉近底物與酶活性中心的距離，因而對酶活性也可能產(chǎn)生影響。作者在此構(gòu)建不同長度VP1u的C端截短突變(圖1)，表達純化MBP融合蛋白，檢測并分析全長MBP-VP1u融合蛋白及截短蛋白的sPLA2活性，研究B19-VP1u保守區(qū)外C端氨基酸對其sPLA2活性的影響。

圖1 B19-VP1u保守區(qū)外C端氨基酸截短方案

1 實驗

1.1 材料和試劑

質(zhì)粒模板PUC18a-VP1u以及VP1u全長MBP融合蛋白MBP-VP1u，自行保存。限制性內(nèi)切酶BamHI、HindⅢ(Promega)；PfuDNA聚合酶、T4DNA連接酶(Takara)；DNA Marker、蛋白Marker(東盛)；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)；pMAL Protein Fusion and Purification System(BioLabs)；sPLA2 Assay Kit(Cayman)、DH5α感受態(tài)細胞(鼎國昌盛)。

1.2 方法

1.2.1 VP1u的C端截短突變基因片段擴增

以質(zhì)粒PUC18a-VP1u為模板，PCR擴增出各截短突變目的片段：VP1u/TC8、VP1u/TC16、 VP1u/TC24。各截短突變的引物序列見表1。

表1 B19-VP1u截短突變基因片段擴增的引物序列

PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。將經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamHI和HindⅢ雙酶切處理純化好的目的基因和pMAL-c2x載體經(jīng)體外T4DNA連接酶過夜連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α并挑取單菌落，堿裂解法提質(zhì)粒并雙酶切驗證。將雙酶切正確克隆測序。

1.2.2 MBP融合蛋白表達及純化

參照pMAL Protein Fusion and Purification System說明書，首先小規(guī)模誘導(dǎo)目的融合蛋白表達，將重組質(zhì)粒pMAL-VP1u/TC8、pMAL-VP1u/TC16、pMAL-VP1u/TC24轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，挑取單菌落過夜搖菌，在IPTG濃度為0.4 mmol·L-1、0.6 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1誘導(dǎo)條件下，分別培養(yǎng)2 h、4 h、6 h后，12%SDS-PAGE分離、考馬斯亮藍染色檢測；而后在300 mL培養(yǎng)基里進行大規(guī)模表達，超聲破碎后離心(6000 g×30 min)，分別收集上清和沉淀SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達形式。取上清用Amylose柱進行親和層析，對目的蛋白進行純化，最后真空干燥濃縮，得到濃度較高的儲存液即蛋白樣，分管保存于-80 ℃。

1.2.3 sPLA2活性檢測

將純化的MBP-VP1u/TC8、MBP-VP1u/TC16、MBP-VP1u/TC24融合蛋白通過Bradford法測定濃度，確保其濃度達到0.5 mg·mL-1以上后，用sPLA2活性測定試劑盒測定其sPLA2的活性，參照sPLA2 Assay Kit說明，選擇Bee Venom作為陽性對照、ddH2O為陰性對照，用96孔板對樣品進行測定，設(shè)3個復(fù)孔，樣品處理后在不同時間段測定414 nm下各樣品吸光值，計算并統(tǒng)計分析各蛋白樣品sPLA2活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 VP1u的C端截短突變重組載體的構(gòu)建及檢測

2.1.1 VP1u的C端截短突變基因片段的PCR擴增

用高保真PfuDNA聚合酶以PUC18a-VP1u質(zhì)粒為模板，以相應(yīng)F、R為上、下游引物分別擴增出大小為660 bp(VP1u/TC8)、636 bp(VP1u/TC16)、612 bp(VP1u/TC24)的PCR產(chǎn)物(圖2)，大小與預(yù)期結(jié)果一致，即為正確的目的片段。

M1.1 kb Marker M2.Marker 1 1～3.VP1u/TC8、VP1u/TC16、VP1u/TC24

2.1.2 VP1u的C端截短突變重組載體雙酶切鑒定

將重組載體經(jīng)雙酶切驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性重組載體可分別得到660 bp(VP1u/TC8)、636 bp(VP1u/TC16)、612 bp(VP1u/TC24)的DNA條帶，與預(yù)期結(jié)果一致(圖3)。將酶切鑒定正確克隆送南京金斯瑞生物公司測序，結(jié)果顯示所插入片段的DNA序列與GenBank中發(fā)表的基因序列完全一致。進一步說明了目的基因已成功插入到pMAL-c2x中。

M1，M3.1 kb Marker M2.Marker 1 1～5.pMAL-VP1u/TC8雙酶切產(chǎn)物 6～8.pMAL-VP1u/TC16雙酶切產(chǎn)物 9～11.pMAL-VP1u/TC24雙酶切產(chǎn)物

2.2 VP1u的C端截短突變蛋白的誘導(dǎo)表達純化及sPLA2活性測定

VP1u的C端截短突變蛋白的小規(guī)模誘導(dǎo)表達結(jié)果顯示，在0.8 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)6 h的條件下，蛋白表達量最大，此后實驗均在該條件下誘導(dǎo)蛋白表達。經(jīng)誘導(dǎo)后在66 kDa附近出現(xiàn)目的條帶 (圖4)， 初步說明VP1u的C端截短突變?nèi)诤系鞍渍T導(dǎo)表達成功。

M.蛋白Marker 1.IPTG誘導(dǎo)的菌種pMAL-c2x 2，4，6.未加IPTG誘導(dǎo)的pMAL-VP1u/TC8、pMAL-VP1u/TC16、pMAL-VP1u/TC24 3，5，7.IPTG誘導(dǎo)的pMAL-VP1u/TC8、pMAL-VP1u/TC16、pMAL-VP1u/TC24

SDS-PAGE檢測結(jié)果表明，大規(guī)模誘導(dǎo)表達的目的蛋白均為可溶性，純化出的目的蛋白顯示為單一條帶(圖5)，說明蛋白純化成功。

M.蛋白Marker 1.IPTG誘導(dǎo)的菌種pMAL-c2x 2.IPTG誘導(dǎo)的pMAL-VP1u/TC8重組菌 3～7.純化后的MBP-VP1u/TC8融合蛋白 8.IPTG誘導(dǎo)的pMAL-VP1u/TC16重組菌 9～13.純化后的MBP-VP1u/TC16融合蛋白 14.IPTG誘導(dǎo)的pMAL-VP1u/TC24重組菌 15～20.純化后的MBP-VP1u/TC24融合蛋白

VP1u全長及C端截短突變?nèi)诤系鞍譻PLA2活性見表2、圖6。

圖6 VP1u全長及C端截短突變?nèi)诤系鞍椎膕PLA2活性

表2VP1u全長及C端截短突變?nèi)诤系鞍譻PLA2的活性

Tab.2sPLA2ActivityofVP1uandC-terminaltruncatedmutants

ProteinsPLA2 Activity/μmol·min-1·mL-1BlankNDBee Venom(10 ng)0.1782±0.0134MBP-VP1u(5 μg)0.2431±0.0616MBP-VP1u/TC8(5 μg)0.2024±0.0458MBP-VP1u/TC16(5 μg)0.0338±0.0118MBP-VP1u/TC24(5 μg)0.0025±0.0010

由表2可知，完整VP1u的蛋白酶活性比陽性對照(Bee Venom)還要高，說明B19-VP1u具有相當(dāng)高的sPLA2活性。C端截短7個氨基酸后的蛋白，其sPLA2活性僅(0.2024±0.0458)μmol·min-1·mL-1,比VP1u(0.2431±0.0616)μmol·min-1·mL-1降低了約2%；截短15個氨基酸時，其活性明顯降低，比VP1u降低了約81%；截短23個氨基酸時，其活性進一步降低，比VP1u降低了約99%，幾乎完全喪失了活性。由此推測，VP1u的C端第8～24個氨基酸之間的區(qū)域?qū)γ富钚杂酗@著的影響，這可能與VP1u蛋白的完整結(jié)構(gòu)、正確折疊和形成有功能的構(gòu)象有密切聯(lián)系。

2.3 討論

由于B19可以通過呼吸道、母嬰、骨髓和器官移植、輸血等多種途徑傳播[11]，在人群中血清檢測的陽性率非常高[12]。B19-VP1u因其結(jié)構(gòu)功能的特異性，受到越來越多的關(guān)注，學(xué)者們開始探尋VP1u的sPLA2活性及其與炎癥反應(yīng)的關(guān)系，以期從中找到B19感染與宿主病理反應(yīng)之間的橋梁。Lu等[13]突變VP1u的第175位氨基酸后，發(fā)現(xiàn)VP1u的sPLA2活性明顯降低，病毒感染性也隨之降低。Canaan等[9]通過突變關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸也獲得了類似的結(jié)果。但B19-VP1u的sPLA2的具體功能仍不明確。

通過查閱相關(guān)文獻，對實驗進行了初步設(shè)計，從B19-VP1u的C端每隔7個或8個氨基酸截短一次，得到VP1u/TC8、VP1u/TC16、 VP1u/TC24 3段截短的基因片段，表達純化獲得3種截短突變的MBP融合蛋白，最后測定VP1u全長及截短突變MBP融合蛋白的sPLA2活性。結(jié)果顯示第8～24個氨基酸序列對酶活有顯著影響，推測這段序列對維持VP1u的正確構(gòu)象有很大作用，缺失后影響了酶活性中心的形成，導(dǎo)致底物不能與其充分接近，從而使sPLA2活性大大降低，但具體機制目前還不清楚。

B19-VP1u保守區(qū)外兩端均有一段氨基酸序列，實驗證明C端序列會對sPLA2活性產(chǎn)生影響，推測N端序列也會對酶活性有所影響，但這還有待進一步驗證。另一方面，依據(jù)sPLA2能催化底物產(chǎn)生脂肪酸這一特性，用VP1u全長及截短突變的融合蛋白處理敏感細胞系，比較細胞在蛋白處理前后脂肪酸濃度的變化，可以進一步闡明正常生理條件下sPLA2的功能。與此同時，可以制備獲得VP1u完整結(jié)構(gòu)的蛋白晶體，更直觀地從蛋白的三維構(gòu)象上揭示sPLA2的天然結(jié)構(gòu)，推測其潛在功能，闡明其在B19感染宿主細胞過程中的作用機理。

3 結(jié)論

為探尋人細小病毒B19-VP1u保守區(qū)外氨基酸序列對VP1u的sPLA2活性的影響，依次截短VP1u保守區(qū)外C端的氨基酸序列，表達純化截短突變的蛋白后分別檢測其sPLA2活性。結(jié)果顯示，截短7個氨基酸時，酶活性沒有明顯變化；但截短15個氨基酸時，酶活性顯著降低；截短23個氨基酸時，幾乎沒有酶活性。表明保守區(qū)外C端的第8～24個氨基酸之間的序列對酶活性有顯著影響，推測其在維持酶的正確三維結(jié)構(gòu)中起重要作用。

參考文獻：

[1] Cossart Y E，F(xiàn)ield A M，Cant B,et al.Parvovirus-like particles in human sera[J].Lancet,1975,305(7898):72-73.

[2] Ozawa K，Kurtzman G，Young N.Replication of the B19 parvovirus in human bone marrow cell cultures[J].Science,1986,233(4766):883-886.

[3] Ozawa K，Ayub J，Hao Y S，et al.Novel transcription map for the B19 (human) pathogenic parvovirus[J].J Virol,1987,61(8):2395-2406.

[4] Erdman D D，Durigon E L，Wang Q Y，et al.Genetic diversity of human parvovirus B19：Sequence analysis of the VP1/VP2 gene from multiple isolates[J].J Gen Virol,1996,77(11)：2767-2774.

[5] Stacie A，Mikio M，Masako K,et al.Peptides derived from the unique region of B19 parvovirus minor capsid protein elicit neutralizing antibodies in rabbits[J].Virology，1995，206(1):626-632.

[6] Rivera R，Chun J.Biological effects of lysophospholipids[J].Rev Physiol Biochem Pharmacol，2008,160:25-46.

[7] Girod A,Wobus C E,Zádori Z,et al.The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity[J].J Gen Virol，2002,83(5)：973-978.

[8] Zádori Z，Szelei J，Tijssen P.SAT：A late NS protein of porcine parvovirus[J].J Virol,2005，79(20):13129-13138.

[9] Canaan S，Zádori Z，Ghomashchi F,et al.Interfacial enzymology of parvovirus phospholipases A2[J].J Biol Chem,2004，279(15):14502-14508.

[10] Filippone C，Zhi N，Wong S，et al.VP1u phospholipase activity is critical for infectivity of full-length parvovirus B19 genomic clones[J].Virology,2008，374(2):444-452.

[11] Anand A，Gray E S，Brown T,et al.Human parvovirus infection in pregnancy and hydrops fetalis[J].N Engl J Med,1987，316(4):183-186.

[12] Anderson L J，Tsou C，Parker R A,et al.Detection of antibodies and antigens of human parvovirus B19 by enzyme-linked immunosorbent assay[J].J Clin Microbiol,1986，24(4):522-526.

[13] Lu J，Zhi N，Wong S，et al.Activation of synoviocytes by the secreted phospholipase A2 motif in the VP1-unique region of parvovirus B19 minor capsid protein[J].J Infect Dis,2006，193(4):582-590.