劉 培，邵鐵梅，盧海剛，柴錫慶，高維娟，安勝軍

(河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北省高校生物反應(yīng)器與蛋白類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)應(yīng)用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050026)

血管外膜成纖維細(xì)胞在血管新生內(nèi)膜形成、不良血管重塑和血管再狹窄病變中的重要作用引起了廣泛的重視［1－3］。隨著對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記、結(jié)構(gòu)蛋白及功能的研究，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞是由許多具有獨(dú)特表型和功能的亞群組成［4］。Das 等［5］和 Stenmark 等［6］對(duì)牛肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞的相關(guān)研究也支持血管外膜成纖維細(xì)胞在形態(tài)及功能特性上有巨大的異質(zhì)性。但是有關(guān)SD大鼠胸主動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞亞群及其在血管功能中的比較研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在獲得SD大鼠胸主動(dòng)脈成纖維細(xì)胞亞群細(xì)胞系，并摸索其生長(zhǎng)特性，比較血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)及其受體拮抗劑氯沙坦(losartan)和PD－123319對(duì)不同細(xì)胞亞群前內(nèi)皮素原－1(preproendothelin－1，preproET－1)mRNA表達(dá)的影響，為在細(xì)胞水平研究血管新生內(nèi)膜形成、不良血管重塑和血管再狹窄機(jī)制提供充足可靠的靶細(xì)胞模型和一定的生理依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，6～8周齡，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(冀)2008－1－003。

2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Lonza BioWhittaker;DMEM/F12和0.25%胰蛋白酶購(gòu)自Gibco;甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購(gòu)自Solarbio;Trizol購(gòu)自Invitrogen;二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、Ang II、losartan 和PD－123319購(gòu)自Sigma;dNTP、Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega;所用引物由上海生工生物技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，見(jiàn)表1、2。

表1 RT－PCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT－PCR

表2 熒光定量PCR引物序列Table 2.Sequences of the primers for fluorecent quantitative PCR

3 主要方法

3.1 血管外膜成纖維細(xì)胞亞群的分離與培養(yǎng) SD大鼠斷頭處死，無(wú)菌條件下取胸主動(dòng)脈，放入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)中，清洗后于手術(shù)鏡下縱向剖開(kāi)血管腔，刮去血管內(nèi)膜和中膜，剩下薄層的血管外膜，轉(zhuǎn)移入含有20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，剪成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，吸棄多余的培養(yǎng)基，將組織塊均勻鋪于培養(yǎng)皿上，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱干涸24 h，待組織塊貼壁后向培養(yǎng)皿中滴加少量含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日補(bǔ)加適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80%融合狀態(tài)時(shí)胰酶消化，并稀釋為5.0×104cells/L的細(xì)胞懸液，取1 mL該懸液補(bǔ)加5 mL新鮮培養(yǎng)液，吹打均勻后移入100 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后換液，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞，采用克隆環(huán)法［7］進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng)，第3 d即可長(zhǎng)出克隆集落，用胰蛋白酶消化傳至24孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)，逐步擴(kuò)增細(xì)胞以獲得足夠的細(xì)胞量，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為第3～5代成纖維細(xì)胞亞群。

3.2 細(xì)胞純度鑒定 為了確認(rèn)成纖維細(xì)胞亞群無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和白細(xì)胞的污染，采用RTPCR來(lái)鑒定，以β－肌動(dòng)蛋白(β－actin)為內(nèi)參照，von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)和結(jié)蛋白(desmin)為平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物，CD8為白細(xì)胞標(biāo)志物，設(shè)計(jì)并合成相關(guān)引物，引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。分別提取大鼠血管外膜組織和成纖維細(xì)胞亞群RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行梯度PCR，循環(huán)體系為1.25 U Taq聚合酶、20 mmol/L Tris－ HCl(pH 8.0)、50 mmol/L KCl、0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L MgCl2和 0.02 μmol/L上、下游引物。循環(huán)程序如下:95℃初始化5 min，95 ℃ 1 min，46 ℃ ～56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)捕獲圖像。

3.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定(MTT法) 血管外膜成纖維細(xì)胞亞群經(jīng)胰酶消化后吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1.0×107cells/L，接種于96孔板，每孔200 μL，每組8孔，其中包括3個(gè)平行對(duì)照孔(只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞)，每24 h測(cè)1組，連續(xù)7 d。具體操作如下:將96孔板于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞貼壁后饑餓24 h，使其生長(zhǎng)同步化。每24 h向1組細(xì)胞中加入20 μL MTT(5 g/L)溶液，繼續(xù)孵育4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(A)，將平行對(duì)照孔調(diào)零，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

3.4 Ang II對(duì)成纖維細(xì)胞亞群preproET－1 mRNA表達(dá)的影響 采用熒光定量PCR檢測(cè)Ang II對(duì)成纖維細(xì)胞亞群preproET－1 mRNA表達(dá)的影響。取長(zhǎng)至80%融合的細(xì)胞亞群，胰酶消化并計(jì)數(shù)，制備1.0×107cells/L細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液種入6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合后棄舊培養(yǎng)液，加入含100 nmol/L Ang II的新鮮培養(yǎng)液，分別于不同時(shí)點(diǎn)(0.5、1.0、1.5、3、6 和12 h)提取細(xì)胞亞群 RNA;進(jìn)一步固定作用時(shí)間，用不同濃度 Ang II(0、10、100和1000 nmol/L)誘導(dǎo)各細(xì)胞亞群并提取RNA。

Ang II受體分為1型(angiotensin II type 1 receptor，AT1受體)和2型(AT2受體)，其拮抗劑分別為losartan和PD－123319。將80%融合的成纖維細(xì)胞亞群分為6組:空白對(duì)照組、losartan組、PD－123319組和Ang II(100 nmol/L)組、Ang II+losartan組和Ang II+PD－123319組。首先用100 μmol/L losartan或PD－123319預(yù)處理30 min，空白對(duì)照組不給予拮抗劑，之后加或不加Ang II(100 nmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后提取RNA。

采用Trizol法提取各組RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。循環(huán)體系中有SBGR Green(20×)，其余與RT－PCR相同，引物設(shè)計(jì)及退火溫度等見(jiàn)表2。循環(huán)程序如下:95℃初始化 2 min，95 ℃ 1 min，48 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共30個(gè)循環(huán)。以看家基因β－actin為內(nèi)參照，采用Rotor－Gene 6000軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，即以處理前細(xì)胞preproET－1和β－actin的比值為1，獲得各個(gè)preproET－1/β－actin的值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖形處理使用GraphPad Prism 5.0軟件，數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，兩兩比較采用LSD－t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 成纖維細(xì)胞亞群形態(tài)學(xué)觀察

克隆環(huán)法體外分離了120個(gè)血管外膜成纖維細(xì)胞亞群，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞從形態(tài)上可分為2個(gè)亞群:圓形細(xì)胞亞群和紡錘形細(xì)胞亞群，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Fibroblast subpopulations isolated from adventitia by cloning rings(×200).A:fibroblast subpopulation derived from adventitial fibroblasts demonstrated a epithelioid appearance，named round cells;B:subpopulation of adventitial fibroblasts appeared spindle shape，named spindle cells.The cells were isolated from 8 different SD rats.圖1 克隆環(huán)法獲得大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞亞群

2 細(xì)胞純度分析

分別提取自圓形細(xì)胞和紡錘形細(xì)胞的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，圓形細(xì)胞和紡錘形細(xì)胞均無(wú)白細(xì)胞標(biāo)志物CD8和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF的表達(dá)，平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物desmin和MHC亦未見(jiàn)表達(dá);相同實(shí)驗(yàn)條件下，血管組織中各標(biāo)記物均表達(dá)，其中β－actin為內(nèi)參照。這表明，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)體外分離的圓形細(xì)胞和紡錘形細(xì)胞無(wú)白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的污染，為純細(xì)胞系。

3 成纖維細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)特性

MTT法可以較準(zhǔn)確地反映活細(xì)胞數(shù)，客觀地反映細(xì)胞的增殖情況。2個(gè)細(xì)胞亞群的生長(zhǎng)趨勢(shì)有所不同，圓形細(xì)胞于第2 d進(jìn)入指數(shù)分裂期，第4 d進(jìn)入平臺(tái)期;紡錘形細(xì)胞于第3 d進(jìn)入指數(shù)分裂期，第5 d進(jìn)入平臺(tái)期，見(jiàn)圖3。

4 Ang II對(duì)成纖維細(xì)胞亞群preproET－1 mRNA表達(dá)的影響

Ang II(100 nmol/L)作用時(shí)間為0.5 h時(shí)，2個(gè)細(xì)胞亞群preproET－1 mRNA表達(dá)量最高，且無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖4。但是從1 h開(kāi)始，preproET－1 mRNA表達(dá)量明顯下降，呈衰減趨勢(shì)。選定作用時(shí)間0.5 h，繼續(xù)觀察不同濃度Ang II(0、10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L)對(duì)preproET－1 mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示:與自身對(duì)照組相比，Ang II呈濃度依賴性顯著增加圓形細(xì)胞preproET－1 mRNA的表達(dá)量(P＜0.01);而對(duì)紡錘形細(xì)胞preproET－1 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響，見(jiàn)圖5。

Figure 2.Result of cell purity identification.Round cells and spindle cells derived from the aorta adventitia showed no expression fo von Willebrand factor(vWF，endothelial cell marker)，CD8(leukocyte marker)，desmin and myosin heavy chain(MHC，vascular smooth muscle cell marker).In contrast，the aorta had strong positive staining for vWF，CD8，MHC and desmin.Both cultured fibroblast subpopulations and aorta tissue expressed β － actin(housekeeping gene).圖2 細(xì)胞純度鑒定結(jié)果

Figure 3.Growth curves of fibroblast subpopulations.For round cells，the exponential phase of growth was from the 2nd day to the 4th day after passage;for spindle cells，the exponential phase of growth was from the 3rd day to the 5th day after passage.圖3 成纖維細(xì)胞亞群生長(zhǎng)曲線

Figure 4.Effects of Ang II(100 nmol/L)on expression of preproET－1 in spindle cells and round cells for various time..n=3.圖4 Ang II不同作用時(shí)間誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞亞群preproET－1 mRNA的表達(dá)

Figure 5.Effects of Ang II on expression of prepro ET－1 in spindle cells and round cells.The cells were incubated with Ang II at various concentrations(0，10 nmol/L，100 nmol/L and 1000 nmol/L)for 0.5 h..n=3.＊＊P ＜0.01 vs control.圖5 不同濃度Ang II對(duì)紡錘形細(xì)胞和圓形細(xì)胞preproET－1 mRNA表達(dá)的影響

圖6中，與對(duì)照組(Ang II組)相比，losartan預(yù)處理30 min后，顯著抑制Ang II誘導(dǎo)的圓形細(xì)胞preproET－1 mRNA的表達(dá)，而對(duì)紡錘形細(xì)胞preproET－1 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響;PD－123319預(yù)處理30 min后，對(duì)圓形細(xì)胞和紡錘形細(xì)胞preproET－1 mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯影響。無(wú)Ang II誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞preproET－1 mRNA的表達(dá)均無(wú)明顯變化，這說(shuō)明Ang II誘導(dǎo)圓形細(xì)胞preproET－1 mRNA的表達(dá)是通過(guò)AT1受體介導(dǎo)的。

Figure 6.Effects of Ang II receptor inhibitors on Ang II－induced expression of preproET－1 mRNA in spindle cells and round cells.The cells were pre－incubated with losartan(100 μmol/L)，an AT1receptor antagonist，or PD －123319(100 μmol/L)，an AT2receptor antagonist，for 30 min.The cells were then incubated with or without Ang II(100 nmol/L)for 30 min..n=3.＊＊P ＜0.01 vs respective control cells.圖6 Ang II受體拮抗劑對(duì)preproET－1 mRNA表達(dá)的影響

討 論

血管由內(nèi)膜、中膜和外膜構(gòu)成，成纖維細(xì)胞是血管外膜的主要細(xì)胞成分［4］。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，血管損傷的主要反應(yīng)在中膜，以平滑肌細(xì)胞增生、遷移為顯著特征，對(duì)血管重構(gòu)的研究多集中在中層平滑肌細(xì)胞上，而忽略了血管外膜改變?cè)谘苤貥?gòu)形成中的作用［8］。近年的研究結(jié)果指出外膜在血管功能中并非只起支持及營(yíng)養(yǎng)作用。在血管損傷后，位于血管外膜的成纖維細(xì)胞由“靜止”狀態(tài)轉(zhuǎn)為“激活”狀態(tài)，遷移至內(nèi)膜下區(qū)域并參與新生內(nèi)膜形成［9］。

Das等［5］對(duì)新生牛肺動(dòng)脈的研究表明，肺動(dòng)脈外膜由很多表型各異的成纖維細(xì)胞亞群組成，牛肺動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞亞群的異質(zhì)性表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)、DNA合成、肌動(dòng)蛋白表達(dá)量及表達(dá)形式等方面。成纖維細(xì)胞亞群的異質(zhì)性在多種動(dòng)物中均有體現(xiàn)，更重要的是，來(lái)自同一種動(dòng)物的成纖維細(xì)胞亞群與來(lái)自其它動(dòng)物的亞群具有驚人的相似性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有關(guān)內(nèi)皮組織和中層組織細(xì)胞異質(zhì)性的報(bào)道相一致［10－12］。

本研究中，我們體外分離了SD大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞亞群(圓形細(xì)胞亞群和紡錘形細(xì)胞亞群)，從形態(tài)上說(shuō)明了成纖維細(xì)胞亞群的異質(zhì)性，并鑒定了細(xì)胞純度，以排除內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及白細(xì)胞的污染，結(jié)果表明2個(gè)細(xì)胞亞群均為血管外膜成纖維細(xì)胞的純細(xì)胞系。除形態(tài)上區(qū)分圓形細(xì)胞和紡錘形細(xì)胞，進(jìn)一步采用MTT法，比較了2種細(xì)胞的增殖能力，根據(jù)各孔吸光度值與細(xì)胞活力的正比關(guān)系，間接反映了細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，結(jié)果顯示2個(gè)細(xì)胞亞群的增殖能力略有差異，圓形細(xì)胞較紡錘形細(xì)胞早1 d進(jìn)入指數(shù)分裂期。

外膜成纖維細(xì)胞在調(diào)節(jié)血管平滑肌功能中的作用目前尚不十分清楚。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)表明外膜細(xì)胞可能在血管損傷和高血壓中起重要作用。相比WKY鼠胸主動(dòng)脈血管外膜成纖維細(xì)胞，自發(fā)性高血壓大鼠的成纖維細(xì)胞有更高的增殖能力。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明在血液動(dòng)力學(xué)和組織水平，ET－1有利于Ang II參與的血管作用。且有報(bào)道指出在鼠成心肌纖維細(xì)胞［13］和主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞［14］中Ang II能誘導(dǎo)的 ET－1表達(dá)。我們前期的研究亦證明血管外膜成纖維細(xì)胞能夠合成和釋放ET－1［15］。在Ang II刺激下，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中ET－1的分泌呈時(shí)間和劑量依賴性，成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)preproET－1 mRNA，蛋白質(zhì)斑跡法檢測(cè)其蛋白的表達(dá)與mRNA水平趨勢(shì)一致，據(jù)此我們推測(cè)外膜源性的ET－1的分泌參與了血管損傷及修復(fù)過(guò)程。外膜ET－1在吸引白細(xì)胞滲透方面也扮演重要角色。研究顯示高血壓在某種程度上是由炎癥引起的。C反應(yīng)蛋白是炎癥的標(biāo)志，在高血壓患者體內(nèi)該蛋白明顯增多，C反應(yīng)蛋白水平亦是高血壓并發(fā)癥的一個(gè)很好的指標(biāo)。ET－1能促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，導(dǎo)致醛固酮依賴性高血壓患者腎臟組織損傷。另外，在局部缺血再灌注誘導(dǎo)的黏膜功能障礙中，ET－1參與多形核白細(xì)胞的滲透。因此，Ang II誘導(dǎo)ET－1的釋放在細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)中的作用以及外膜ET－1的其它作用很重要。本文就成纖維細(xì)胞的2個(gè)亞群的細(xì)胞功能進(jìn)行了比較研究。在(0～1000)nmol/L濃度范圍內(nèi)，Ang II濃度依賴性地增加了圓形細(xì)胞preproET－1 mRNA的表達(dá)，而對(duì)紡錘形細(xì)胞內(nèi)preproET－1 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著影響，該結(jié)果顯示Ang II誘導(dǎo)圓形細(xì)胞prepro-ET－1 mRNA的表達(dá)是通過(guò)AT1介導(dǎo)的，AT1拮抗劑losartan阻斷了Ang II誘導(dǎo)ET－1表達(dá)量的增加。

綜上所述，本研究成功分離了SD大鼠血管外膜成纖維細(xì)胞亞群，比較了2個(gè)亞群的增殖能力，并分析了Ang II對(duì)2個(gè)細(xì)胞亞群preproET－1表達(dá)的影響。為從細(xì)胞分子水平研究心血管疾病病因、機(jī)制和防治奠定了基礎(chǔ)。據(jù)此我們推測(cè)成纖維細(xì)胞的2個(gè)亞群在遷移能力、表型分化及肌動(dòng)蛋白表達(dá)等功能特性上亦存在差異，可能不同程度地參與新生內(nèi)膜的形成和血管重構(gòu)等過(guò)程，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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