張繼君，謝思明，林琛蒞，翁澤平，杜 展，王 超，鐘雪云

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東 廣州 510632)

惡性膠質(zhì)瘤是成年人中最為常見(jiàn)的原發(fā)性腦腫瘤，盡管手術(shù)、放化療技術(shù)不斷發(fā)展，但膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然較差。膠質(zhì)瘤的預(yù)后情況與其分化程度密切相關(guān)，高級(jí)別的膠質(zhì)瘤包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和間變性星形細(xì)胞瘤都具有較低的分化水平和較高的死亡率，尤其是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人中位生存時(shí)間還不到1年［1］。通過(guò)各種手段努力提高膠質(zhì)瘤的分化水平已成為膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵所在。

維甲酸是目前研究應(yīng)用最為廣泛的誘導(dǎo)分化劑之一，全反式維甲酸(all－trans retinoic acid，ATRA)聯(lián)合三氧化二砷(arsenic trioxide，As2O3)已經(jīng)成功應(yīng)用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療并且取得顯著的療效［2］，但是ATRA在實(shí)體腫瘤和其它類型白血病應(yīng)用不多。維甲酸作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞能否誘導(dǎo)其分化，維甲酸在膠質(zhì)瘤中合成過(guò)程又受到哪些因素的影響?這些都是值得我們深入探討的問(wèn)題。

醛脫氫酶1家族成員A1(aldehyde dehydrogenase 1 family member A1，ALDH1A1)將維甲酸的前體氧化成維甲酸［3－5］，從而在維甲酸合成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。KLF9(Krüppel－ like transcription factor 9)屬于17個(gè)KLFs家族成員之一，具有誘導(dǎo)神經(jīng)球細(xì)胞分化，抑制神經(jīng)球形成的能力［6］。前期研究已經(jīng)證明KLF9在SWO－Z2細(xì)胞中有表達(dá)，ALDH1A1基因在SWO－Z2中相對(duì)高表達(dá)。最近的研究表明子宮內(nèi)膜癌中KLF9的表達(dá)高低與惡性程度負(fù)相關(guān)，并且KLF9可以調(diào)控ALDH1A1基因的表達(dá)［7］，在膠質(zhì)瘤中是否有同樣的調(diào)控關(guān)系目前還沒(méi)有研究報(bào)道。本文通過(guò)小分子干擾實(shí)驗(yàn)來(lái)證明KLF9和ALDH1A1存在一定的調(diào)控關(guān)系，同時(shí)用ATRA處理SWO－Z2細(xì)胞觀察其增殖分化能力變化，探討維甲酸在膠質(zhì)瘤中可能的合成調(diào)節(jié)過(guò)程，旨在研究膠質(zhì)瘤細(xì)胞維甲酸的可能合成調(diào)控機(jī)制，以及維甲酸對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖分化作用及其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 主要材料與儀器

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO－38由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室自建［8］，SWO－Z2細(xì)胞從 SWO－38細(xì)胞系中通過(guò)單克隆形式分離獲得［9］;ATRA、9－cis RA和13－cis RA均購(gòu)于 Sigma;改良型 RPMI－1640購(gòu)自HyClone;CCK－8購(gòu)自WST;Real－time PCR試劑盒購(gòu)于 TaKaRa;KLF9抗體購(gòu)于Santa Cruz;ALDH1A1抗體購(gòu)于 Abcam;cyclin D1、cleaved PARP、Bcl－2、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic portein，GFAP)和內(nèi)參照β－actin均購(gòu)自CST;細(xì)胞裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于碧云天公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自Pierce;小分子干擾序列(si－RNA KLF9)由銳博公司設(shè)計(jì)合成;Real－time PCR引物由英俊公司合成;LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購(gòu)于Invitrogen;垂直電泳槽及半干式電轉(zhuǎn)移儀器均購(gòu)自Bio－Rad。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SWO－Z2細(xì)胞于5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為改良型RPMI－1640培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SWO－Z2細(xì)胞(不含抗生素的培養(yǎng)基)，以1.5 ×105cells/well接種于6孔板，24 h后細(xì)胞密度達(dá)到大約40%左右的匯合度。

2.2 siRNA－脂質(zhì)體混合物的制備及轉(zhuǎn)染 制備過(guò)程嚴(yán)格遵守脂質(zhì)LipofectamineTM2000脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)要求，優(yōu)化siRNA和脂質(zhì)體的用量進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率。最終選用的siRNA濃度為50 nmol/L，稀釋siRNA和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑所選用的培養(yǎng)基均不含血清和抗生素，轉(zhuǎn)染約6h后更換含有血清不含抗生素的培養(yǎng)基。

2.3 RT－PCR法檢測(cè)SWO－Z2細(xì)胞維甲酸受體(retinoic acid receptors，RARs)mRNA 水平，以及KLF9被干擾后KLF9和ALDH1A1 mRNA表達(dá) 分別提取SWO－Z2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染24 h后SWO－Z2細(xì)胞的RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA樣品純度和含量，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)后的cDNA作為PCR的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RARα上游引物5'－GACCGGCTCTTGAGACATCC－3'，下游引物5'－GGTGCTGGAGAGTGGTCAGA－3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為372 bp。RARβ上游引物 5'－GGAACGCATTCGGAAGGCTT －3'，下游引物5'－GCAAGACGG ACTCGCAGTGT－3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為383 bp。維甲類X受體 α(retinoid X receptor α，RXRα)上游引物 5'－TCCTTCTCCCACCGCTCCATC－3'，下游引物 5'－CAGCTCCGTCTTGTCCATCT G－3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為169 bp。KLF9上游引物 5'－TGGCTGTGGGAAAGTCTATGG －3’，下游引物 5'－CTCGTCTGAGCGGGAGAACT－3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為124 bp。ALDH1A1上游引物5’－CTCCTCTCACGGCTCTTCAC－3’，下游引物 5'－CCATGGTGTGCAAACTCAA C －3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為289 bp。陽(yáng)性對(duì)照GAPDH上游引物5'－ACAGTCAGCCGCATCTTCTT －3’，下游引物 5'－GACAAGCTTCCCGTTCTCAG －3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為259 bp。內(nèi)參照β－actin上游引物5'－GTGGGGCGCCCCAGGCACCA －3'，下游引物 5'－CTCCTTAATGTCACGCACGATTT－3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度為540 bp。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 3 s，55.6 ℃ 6 s，72 ℃10 s，40 個(gè)循環(huán)，2－ΔΔCt法分析沉默效率。取 PCR 產(chǎn)物5 μL瓊脂糖凝膠電泳，Bio－Rad凝膠電泳成像儀攝像，運(yùn)用Quantity One軟件對(duì)條帶進(jìn)行累計(jì)吸光度值(IA)測(cè)定，并計(jì)算目的基因與內(nèi)參照基因條帶灰度的相對(duì)比值［10］。

2.4 維甲酸對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞SWO－Z2的增殖抑制作用 應(yīng)用CCK8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率［11－13］，SWO － Z2 細(xì)胞經(jīng) 2.5%胰酶消化后，改良型RPMI－1640完全培養(yǎng)基制備2×107cells/L細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL。24 h后處理組分別加入梯度濃度的9－cis RA、13－cis RA和ATRA，0.1%DMSO為對(duì)照組，每組濃度均設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。72 h后每孔加入10 μL CCK－8溶液，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻。37℃繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)630 nm處測(cè)得A值，取6個(gè)復(fù)孔的平均值，按公式計(jì)算增殖抑制率［增殖抑制率=(1－實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值)×100%］，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

2.5 Western blotting法檢測(cè)沉默48 h后 KLF9和ALDH1A1蛋白，以及ATRA作用SWO－Z2細(xì)胞72 h后 GFAP、cleaved PARP、Bcl－2和 cyclin D1的蛋白表達(dá)情況 按試劑盒上說(shuō)明書(shū)要求提取全細(xì)胞蛋白:收集細(xì)胞，離心后棄培養(yǎng)基，PBS(pH=7.2～7.4)洗滌細(xì)胞，按照1×1012cells/L加入預(yù)冷的RIPA Buffer和PMSF混合液。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每孔蛋白量30 μg于12%和5%聚丙酰胺凝膠上電泳，電泳條件:0.02A恒流30 min，0.04 A恒流100 min;轉(zhuǎn)膜條件:0.35 A濕轉(zhuǎn)60 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%BSA室溫封閉100 min后剪下包含目的蛋白的 PVDF膜，加入Ⅰ抗 Bcl－2(1∶1000)、cleaved PARP(1∶1000)、cyclin D1(1∶600)、GFAP(1∶500)和內(nèi)參照 β －actin(1∶1000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，TBST洗膜每次10 min，共3次，HRP標(biāo)記抗體Ⅱ抗(1∶5000)室溫孵育1 h后TBST洗滌每次10 min，共3次。加強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(ECL)發(fā)光，X光膠片暗室曝光、顯影、洗片。BI2000灰度掃描分析條帶IA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，進(jìn)行兩樣本t檢驗(yàn)和One－way ANOVA，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 KLF9 RNAi沉默后 KLF9和ALH1A1 mRNA的表達(dá)

RNAi干擾24 h real－time PCR結(jié)果顯示，干擾后KLF9及ALDH1A1 mRNA水平與對(duì)照組相比明顯下降(P＜0.01)。有效的干擾濃度為50 nmol/L，干擾效率超過(guò)50%。2－ΔΔCt法計(jì)算干擾前后mRNA表達(dá)差異倍數(shù)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Expression levels of KLF9 and ALDH1A1 mRNA detected by real－time PCR after KLF9 silencing.GAPDH served as a positive control..n=3.*P＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control.圖1 50 nmol/L RNAi沉默 KLF924 h后 KLF9和 ALDH1A1 mRNA的表達(dá)

2 KLF9沉默后KLF9和ALDH1A1蛋白的表達(dá)

小分子RNA干擾KLF9基因，有效濃度為50 nmol/L，48 h后Western blotting結(jié)果顯示，KLF9蛋白(條帶位于約32 kD)表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)，ALDH1A1蛋白(條帶位于約55 kD)表達(dá)也顯著下降(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Down－regulation of KLF9 and ALDH1A1 protein expression in SWO－Z2 cells with KLF9 siRNA treatment..n=3.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control group.圖2 KLF9沉默48 h后KLF9和ALDH1A1蛋白的表達(dá)

3 不同的維甲酸對(duì)SWO－Z2細(xì)胞的增殖抑制作用

在加入3種不同維甲酸72 h后，細(xì)胞增殖能力在不同程度上受到抑制，而相同濃度和作用時(shí)間條件下，3種不同維甲酸對(duì)SWO－Z2細(xì)胞的增殖抑制作用不同，其中ATRA效果最佳，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Chagnes of the three kinds of retinoic acid on proliferation of SWO－Z2 cells detected by CCK－8 assay..n=3.＊＊P ＜0.01 vs 9 － cis RA or 13 － cis RA.圖3 CCK－8法檢測(cè)3種不同的維甲酸對(duì)SWO－Z2細(xì)胞增殖活性的影響

4 不同濃度的ATRA作用SWO－Z2細(xì)胞72 h后cyclin D1、cleaved PARP、Bcl－2和 GFAP 的變化

不同濃度ATRA(DMSO濃度＜0.1%)分別處理SWO－Z2細(xì)胞72 h后 Western blotting結(jié)果表明，cleaved PARP蛋白表達(dá)上調(diào)(P＜0.01)，Bcl－2蛋白表達(dá)下降(P＜0.05)，cyclin D1蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)(P＜0.05)，細(xì)胞增殖能力下降甚至發(fā)生了凋亡，但GFAP在藥物處理前后沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明ATRA并沒(méi)有促進(jìn)膠質(zhì)瘤的分化，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Western blotting was used to analyze the expression of cleaved PARP，cyclin D1，Bcl－2 and GFAP in SWO－Z2 cells treated with different concentrations of ATRA for 72 h.1:control group;2:5 μmol/L ATRA;3:20 μmol/L ATRA;4:50 μmol/L ATRA..n=3.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs control group.圖4 不同濃度ATRA處理SWO－Z2細(xì)胞72 h后cleaved PARP、Bcl－2、cyclin D1和 GFAP 蛋白的表達(dá)

5 SWO－Z2細(xì)胞及ATRA處理后維甲酸受體的表達(dá)

結(jié)果表明，3種不同維甲酸受體在SWO－Z2細(xì)胞中表達(dá)很低，條帶非常弱，而且在不同濃度ATRA處理下3種受體mRNA表達(dá)幾乎沒(méi)有變化，見(jiàn)圖5。

Figure 5.Real－time PCR detection for the expression of RARα，RARβ and RXRα in SWO－Z2 cells..n=3.圖5 3種維甲酸受體在SWO－Z2細(xì)胞的表達(dá)以及ATRA對(duì)3種受體表達(dá)的影響

討 論

近年來(lái)隨著維甲酸能夠成功治愈急性早幼粒細(xì)胞白血病，人們又不斷研究維甲酸在其它實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用。惡性膠質(zhì)瘤由于侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)后病理級(jí)別上升和腫瘤異質(zhì)性等自身獨(dú)特的生物學(xué)特征，導(dǎo)致其治療非常棘手。而傳統(tǒng)手術(shù)切除、放化療以及顯微外科技術(shù)、免疫治療和基因治療等先進(jìn)診療技術(shù)都未能顯著的提高膠質(zhì)瘤病人的5年生存率。維甲酸信號(hào)在調(diào)控胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，同時(shí)維甲酸信號(hào)調(diào)控異常是膠質(zhì)瘤發(fā)病過(guò)程中的重要事件［5］，所以研究膠質(zhì)瘤中的維甲酸信號(hào)是進(jìn)行膠質(zhì)瘤誘導(dǎo)治療方案的重要基礎(chǔ)。

維甲酸在體內(nèi)的合成主要包括兩次氧化過(guò)程［14］，其中ALDH1A1在維甲酸前體氧化成為維甲酸(第二次氧化)的步驟中發(fā)揮重要作用［3－4］。KLF9又稱為基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、增殖分化以及細(xì)胞周期的調(diào)控，在維甲酸和血清兩種分化信號(hào)存在下KLF9的表達(dá)上調(diào)發(fā)揮誘導(dǎo)神經(jīng)球分化抑制神經(jīng)球形成的能力［15］。我們前期基因芯片、實(shí)時(shí)定量PCR以及Western blotting結(jié)果(待發(fā)表)都表明ALDH1A1和KLF9基因在SWO－Z2細(xì)胞中高表達(dá)，所以維甲酸的合成代謝和KLF9基因的表達(dá)情況可能存在密切的關(guān)系。通過(guò)基因沉默證實(shí)KLF9是ALDH1A1的上游調(diào)控基因，并且正調(diào)控ALDH1A1基因的表達(dá)促進(jìn)維甲酸的合成，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在維甲酸合成調(diào)控信號(hào)。但是不同濃度的ATRA對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有抑制增殖作用，并且抑制效率與ATRA濃度呈正相關(guān)，同時(shí)不同濃度ATRA對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的GFAP表達(dá)幾乎沒(méi)有變化，而抑制增殖作用相關(guān)蛋白發(fā)生相應(yīng)變化，這些說(shuō)明ATRA作用于人腦膠質(zhì)瘤并沒(méi)有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤分化而是抑制膠質(zhì)瘤的增殖甚至發(fā)生凋亡。

與膠質(zhì)瘤相似，ATRA作用于實(shí)體腫瘤如非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞［16］和肝癌細(xì)胞［17］會(huì)引起增殖抑制，凋亡標(biāo)志物誘導(dǎo)表達(dá)，這些都說(shuō)明ATRA在實(shí)體腫瘤中主要抑制腫瘤細(xì)胞增殖甚至發(fā)生凋亡。至于維甲酸在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮抑制增殖作用而沒(méi)有誘導(dǎo)其分化的原因尚不清楚。維甲酸既然在膠質(zhì)瘤中存在合成調(diào)節(jié)但是具有誘導(dǎo)分化的作用，主要的原因是維甲酸受體在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)比較低或者缺失導(dǎo)致其沒(méi)有作用靶點(diǎn)。維甲酸受體包括兩類，即 RARs和RXRs，其中前者是維甲酸發(fā)揮誘導(dǎo)分化作用的主要受體。我們進(jìn)一步檢測(cè)了SWO－Z2細(xì)胞中的3種維甲酸受體，結(jié)果表明維甲酸受體在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中比較低。而且在本研究中，不同濃度的ATRA作用于SWO－Z2細(xì)胞后，維甲酸受體表達(dá)幾乎沒(méi)有發(fā)生變化，可能的原因就是在細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性發(fā)生變異，因?yàn)橛醒芯勘砻髟囵B(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)維甲酸的敏感性高于膠質(zhì)瘤細(xì)胞株［18］。

綜上所述，一方面在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中KLF9通過(guò)正調(diào)控ALDH1A1的表達(dá)促進(jìn)維甲酸的合成;另一方面維甲酸作用于人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞未能誘導(dǎo)分化而是引起腫瘤細(xì)胞的增殖抑制甚至發(fā)生凋亡，主要原因可能就是膠質(zhì)瘤中的維甲酸受體表達(dá)較少且敏感性改變。本實(shí)驗(yàn)為利用維甲酸對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖抑制作用發(fā)揮抗腫瘤作用提供有力證據(jù)，同時(shí)也為提高維甲酸受體對(duì)藥物的敏感性從而應(yīng)用維甲酸誘導(dǎo)治療膠質(zhì)瘤提供新的思路。

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