金 海，劉慧玲，李學(xué)俊，馮智英，王 冰，楊建旭，汪根樹△，吳 斌

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院1肝臟移植中心，中山大學(xué)器官移植研究所，廣東省器官移植中心，2消化內(nèi)科，3肝病內(nèi)科，4病理科，廣東 廣州 510630)

Hedgehog(Hh)信號通路是動物發(fā)育過程中重要的細(xì)胞間通訊，可調(diào)節(jié)許多成體組織器官干細(xì)胞的自我更新與增殖，維持正常的組織器官形態(tài)和功能。在組織器官損傷時Hh信號通路被激活，促進(jìn)組織干細(xì)胞的分化和增殖以修復(fù)損傷。對人和鼠的研究顯示，多種肝臟損傷時出現(xiàn)Hh信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)，提示Hh信號可能被激活，通過刺激肝臟干細(xì)胞分化增殖以修復(fù)肝臟損傷［1－2］。Hh信號通路是否參與了部分肝臟切除術(shù)后的肝再生罕有研究報道。本研究建立大鼠部分肝臟切除術(shù)模型，檢測術(shù)后肝臟Hh信號通路相關(guān)蛋白Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和 Glioblastoma－2(Gli－2)的表達(dá)，探討Hh信號通路在部分肝臟切除術(shù)后肝再生中的作用。

材料和方法

1 材料

清潔級健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠18只，重200～250 g，購自中山大學(xué)動物實驗中心。主要試劑和儀器包括:二步法抗兔/鼠通用型Ki－67免疫組化檢測試劑盒(GK500705，基因科技公司)，鼠來源Shh單克隆抗體(s8321，Sigma)，兔來源Ihh單克隆抗體(ab52919，Abcam)，兔來源 Gli－2多克隆抗體(sab2900411，Sigma)，倒置顯微鏡和照相系統(tǒng)(Leica)。術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。

2 方法

2.1 大鼠部分肝切除模型的建立 10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，固定，腹部備皮，Ⅲ型安爾碘消毒腹部，取中上腹部正中切口，切開腹壁各層，切斷肝周韌帶，充分暴露肝臟，先用7－0絲線結(jié)扎各肝葉Glisson系統(tǒng)，然后用3－0絲線結(jié)扎肝蒂后切斷肝葉。切除肝左內(nèi)側(cè)葉、左外側(cè)葉、中葉，約占大鼠全肝重量的70%。腹部給予2～3 mL生理鹽水補(bǔ)充術(shù)中失水，然后用3－0絲線連續(xù)縫合腹部切口關(guān)腹。術(shù)后保暖，單籠飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

2.2 實驗分組和標(biāo)本采集 18只SD大鼠隨機(jī)均分為3組:假手術(shù)組(A)、部分肝切除術(shù)組1(B)、部分肝切除術(shù)組2(C)。A、B組于術(shù)后24 h、C組于術(shù)后48 h按照前述方法開腹切取肝組織。取材方法:小心取下剩余肝葉(右外葉、三角葉和乳頭葉)，用溫生理鹽水沖洗3次，分成均衡的兩部分，一部分用4%中性福爾馬林固定，另一部分用凍存管裝好保存在液氮罐內(nèi)。

2.3 檢測指標(biāo)和檢測方法 檢測指標(biāo)包括肝組織HE染色和肝組織 Ki－67、Shh、Ihh、Gli－2的表達(dá)。肝組織切片行常規(guī)蘇木素和伊紅染色法檢測組織病理損傷，由專業(yè)病理科醫(yī)師進(jìn)行結(jié)果判斷;肝組織Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2的表達(dá)采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結(jié)法檢測(免疫組化法)和 Western blotting法。Ki－67、Shh、Ihh 和 Gli－2免疫組化陽性結(jié)果判斷:細(xì)胞質(zhì)(Shh、Ihh)或細(xì)胞核(Ki－67、Gli－2)呈現(xiàn)棕褐色顆粒狀染色為陽性反應(yīng)。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗。

結(jié) 果

1 肝組織HE染色

HE染色顯示A組肝細(xì)胞和肝小葉形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;B組可見肝竇擴(kuò)張淤血和肝細(xì)胞水腫，并可見點狀壞死，肝索、肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常;C組除肝竇擴(kuò)張淤血、肝細(xì)胞水腫、點狀壞死之外，還可見肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，另可見處于不同分裂期細(xì)胞，見圖1。

2 肝組織Ki－67、Shh、Ihh和 Gli－2的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)法檢測肝細(xì)胞Ki－67的表達(dá)評估各組術(shù)后肝臟的再生情況。B、C組Ki－67表達(dá)明顯高于 A組(P＜0.01)，C組高于 B組(P＜0.01)，見圖2、表1。用免疫組織化學(xué)法檢測肝細(xì)胞Shh、Ihh和Gli－2的表達(dá)評估術(shù)后各組肝臟Hh信號通路的表達(dá)情況。B、C組Shh、Ihh和Gli－2表達(dá)高于A組(P＜0.01)，C組高于B組(P＜0.01)，見圖3、表1。用Western blotting法檢測肝組織中Shh、Ihh的表達(dá)情況，其結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致，見圖4。各組別數(shù)據(jù)顯示Shh、Ihh和Gli－2表達(dá)強(qiáng)度與肝臟細(xì)胞增殖程度一致。

Figure 1.HE staining of rat liver tissues in each group(×400).A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).圖1 各組別HE染色結(jié)果

Figure 2.A proliferation marker，Ki－67，was evaluated using immunohistochemistry in each group(×400).Ki－67 positive cells are brown.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).圖2 增殖細(xì)胞標(biāo)志物Ki－67在各組的表達(dá)情況

Figure 3.Expression of Hh ligands(Shh，Ihh)and Hh transcription factor(Gli－2)in rat livers in each group(×400).Shh，Ihh and Gli－2 positive cells are brown.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).圖3 各組Shh、Ihh和Gli－2的表達(dá)情況

表1 各組Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2陽性細(xì)胞數(shù)Table 1.The number of Ki－67，Shh，Ihh and Gli－2 positive cells in the liver from each group(.n=6)

表1 各組Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2陽性細(xì)胞數(shù)Table 1.The number of Ki－67，Shh，Ihh and Gli－2 positive cells in the liver from each group(.n=6)

Fifteen randomly－chosen fields(×400)in each section were evaluated.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).＊＊P ＜0.01 vs group A;##P ＜0.01 vs group B.

Group Ki－67 Shh Ihh Gli－2 A 4.17±1.47 6.17±1.47 11.83±1.94 6.83±1.60 B 14.33±2.25＊＊ 10.17±1.72＊＊ 20.17±1.17＊＊ 27.83±6.74＊＊C 115.00±4.56## 30.50±1.64## 38.17±4.12##67.50±12.11##

Figure 4.Expression of Hh ligands(Shh，Ihh)examined by Western blotting in rat livers in each group.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(48 h);C:partial hepatectomy(24 h).圖4 各組Shh和Ihh的表達(dá)情況

討 論

Hh信號通路［3］由Hedgehog配體、2個跨膜蛋白受體Patched(Ptch)和 Smoothened(Smo)，以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白等組成。在哺乳動物中存在3種Hh成員，即 Shh、Ihh 及 Desert Hedgehog(Dhh)，均為分泌性蛋白。Ptch和Smo是位于細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，其中Ptch為Hedgehog的受體，能與3種Hh蛋白結(jié)合。當(dāng)不存在Hh蛋白時，Ptch抑制Smo的活性進(jìn)而抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。當(dāng)Hh蛋白與Ptch結(jié)合時，Ptch對Smo的抑制效應(yīng)被解除，激活下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Gli，即可誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)。Hh信號通路可調(diào)節(jié)許多成體組織器官干細(xì)胞的自我更新與增殖，維持正常的組織器官形態(tài)和功能。

對人類原發(fā)性膽汁性肝硬化、酒精性肝病和對大鼠膽管結(jié)扎、酒精性和非酒精性脂肪肝、乙硫氨酸中毒肝臟以及缺血再灌注肝臟模型的研究［4－6］顯示，各種肝臟損傷時肝臟組織中出現(xiàn)Hh信號通路相關(guān)蛋白和肝臟干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，推測肝損傷時Hh信號通路可能被激活，通過刺激肝干細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞的分化和增殖以修復(fù)肝臟損傷。體外實驗發(fā)現(xiàn)Shh可以抑制小管細(xì)胞凋亡，Hh信號通路抑制劑可以抑制培養(yǎng)的肝母細(xì)胞瘤的生長［7］。

在部分肝切除術(shù)后肝臟組織缺損，肝再生可以部分或全部恢復(fù)肝臟原來體積和形狀，其中包括肝細(xì)胞、膽管和血管等組織的再生修復(fù)。在活體部分供肝移植和劈離式肝移植術(shù)后［8］，移植肝臟通常能迅速再生，部分或全部恢復(fù)肝臟原來體積和形狀。肝臟這種再生修復(fù)組織缺損的機(jī)理尚不明確。較早的研究認(rèn)為肝損傷后肝再生要依賴于分化成熟的肝細(xì)胞重新活化增殖。肝臟損傷后可分泌相關(guān)調(diào)控因子(如 tumor necrosis factor α、interleukin － 6、cyclin D1、immediate early gene、hepatocyte growth factor等)刺激肝細(xì)胞再活化增殖，修復(fù)損傷［9－11］。目前認(rèn)為肝損傷是由肝干細(xì)胞增生和分化來修復(fù)的。肝干細(xì)胞是肝組織中具有自我更新和分化為肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的不成熟細(xì)胞，在生理條件下負(fù)責(zé)更新衰老死亡的肝組織細(xì)胞，維持肝臟結(jié)構(gòu)和功能的完整性;在病理條件下如肝組織缺損、細(xì)胞壞死等，肝干細(xì)胞可增生和分化修復(fù)肝損傷。成年肝臟上皮祖細(xì)胞為Hh反應(yīng)細(xì)胞。胚胎期和成年靈長類肝臟的各型上皮祖細(xì)胞都能產(chǎn)生Hh配體或?qū)χ畱?yīng)答。

本實驗顯示在部分肝切除術(shù)后，殘肝組織中出現(xiàn)細(xì)胞水腫和壞死，至48 h可見處于不同分裂期細(xì)胞，細(xì)胞增生標(biāo)志物Ki－67開始表達(dá)，說明肝臟干細(xì)胞開始增殖以修復(fù)肝組織缺損。本實驗還顯示在部分肝切除術(shù)后，殘肝組織中可見 Hh信號蛋白Shh、Ihh和Gli－2的表達(dá)，且它們的表達(dá)強(qiáng)度與肝細(xì)胞增生標(biāo)志物Ki－67的表達(dá)程度一致。提示在部分肝切除術(shù)后Hh信號通路被激活，可能誘導(dǎo)肝臟干細(xì)胞分化和增殖，修復(fù)肝臟缺損。這與Ochoa等［11］報道Hh信號通路在部分肝切除術(shù)后激活并可能促進(jìn)肝臟再生的結(jié)果一致。

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