宋紅苗，馬 杰，徐祥彬

(杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036)

從植物組織中提取純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行分子生物學(xué)方面研究，如 cDNA合成、Northern雜交、mRNA分離、RT-PCR、cDNA文庫構(gòu)建及體外翻譯等的必要前提和關(guān)鍵。許多生物材料在提取核酸時，都會遇到多糖的污染問題。多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，很難將它們分開，在去除多糖的同時RNA也容易被裹帶走，造成RNA產(chǎn)量的減少。在沉淀RNA時，也容易產(chǎn)生含有多糖的RNA凝膠狀沉淀，這種RNA沉淀難溶于水，或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。此外，多糖還可以抑制許多酶的活性［1］，因此污染了多糖的 RNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

果實中富含多糖類物質(zhì)，在提取過程中能與RNA共同沉淀，很難將其分開，從而影響RNA的質(zhì)量，影響進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。為了能獲得高質(zhì)量的RNA，我們對果實RNA提取技術(shù)進(jìn)行了探索。通過反復(fù)探索，我們利用醋酸鉀沉淀多糖，結(jié)合多次氯仿抽提和LiCl沉淀RNA的方式，得到了一個可以在冬棗、葡萄、甜櫻桃、桃、番茄等含不同豐度多糖的果實中適用的RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試果實有葡萄，甜櫻桃，冬棗，桃子和番茄。

供試生物化學(xué)試劑有水飽和酚、氯仿、醋酸鉀、Tris堿、70% 乙 醇、SDS、DEPC、NaCl和LiCl。

溶液配制參照分子克隆實驗指南第2版。

RNA 提 取 液 配 制:50 mmol·L－1Tris-HCl(pH 值 9.0)，100 mmol NaCl，1%SDS。

1.2 RNA提取和檢測

取果實10 g，置液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)移至經(jīng)DEPC處理過的50 mL離心管中，然后加入20 mL預(yù)熱到65℃的水飽和酚/RNA提取液(7 mL水飽和酚，13 mL RNA提取液)，混勻后劇烈振蕩10 min，再加入10 mL氯仿，混勻，4℃靜置5 min，10 000 g離心20 min，然后取上清液轉(zhuǎn)移至一個新的經(jīng)DEPC處理過的50 mL離心管，再加入1/3體積醋酸鉀(pH值4.8，5 mol·L－1)，混勻，再劇烈振蕩5 min，4℃靜置30 min，10 000 g離心20 min，再將上清液轉(zhuǎn)移至另一個新的經(jīng)DEPC處理過的50 mL離心管，加入等體積氯仿，抽提10 min，10 000 g離心30 min(氯仿抽提步驟重復(fù)2～3次)。最后取上清液，加入1/3體積的 LiCl(8 mol·L－1)，混勻，于4℃ 放置 12 h以上沉淀RNA，然后4℃下10 000 g離心20 min，棄上清留沉淀，用70%的乙醇洗滌后，吹干沉淀，用適量DEPC處理的ddH2O溶解RNA。

分光光度法檢測RNA。分別取1 μL葡萄、冬棗、甜櫻桃、桃和番茄的RNA，用Nanodrop分光光度計測定 D260、D280和 D230，通過 D260/D280和D260/D230的比值來檢測果實 RNA含量、質(zhì)量和純度。

電泳法檢測 RNA。分別取2 μL葡萄、冬棗、甜櫻桃、桃和番茄的RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

2 結(jié)果和分析

2.1 分光光度法檢測果實總RNA的含量和質(zhì)量

表1結(jié)果表明，用分光光度法在5種含糖量較高的果實中提取的RNA都具有較高的質(zhì)量和含量。

表1 分光光度法檢測的果實總RNA含量和質(zhì)量

2.2 凝膠電泳檢測總RNA的完整性

取2 μL提取的葡萄、冬棗、甜櫻桃、桃、番茄RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過凝膠成像可以觀測到比較完整的 RNA(圖1)，其中28S RNA的亮度大約是18S RNA的2倍。

圖1 不同果實提取的RNA凝膠電泳

3 小結(jié)和討論

果實成熟是一個復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控過程，伴隨著許多生理生化變化，除呼吸上升、乙烯合成、果實軟化和色素轉(zhuǎn)變外，糖等風(fēng)味物質(zhì)的含量也產(chǎn)生了很大的變化。果實采收前以淀粉的方式積累的碳水化合物，隨著果實成熟的進(jìn)程，被淀粉酶水解成可溶性糖，使其含糖量升高［2－4］。冬棗、葡萄、甜櫻桃、桃、番茄等果實含有不同程度的多糖，其中冬棗含有34%～40%的多糖，葡萄含有15%～30%的多糖，甜櫻桃含有12%～15%的多糖，桃含有6%～15%的多糖，番茄含有2%左右的多糖。為了在果實中能獲得高質(zhì)量的RNA，有效去處多糖，本文我們對含不同程度多糖的果實RNA提取技術(shù)進(jìn)行了探索。

通過醋酸鉀(pH值 4.8，5 mol·L－1)沉淀多糖，再經(jīng)過3次的氯仿重復(fù)抽提，最后經(jīng)過LiCl(8 mol·L－1)沉淀RNA，結(jié)果證明，用該方法提取的果實總RNA完整性好，純度高，提取的RNA的數(shù)量也比較大，可以在1 g果實中提取到大約35 μg左右的總RNA。RNA樣品純度也已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的D260/D280為1.8～2.2和 D260/D230＞1.0，完全可以滿足基本的分子生物學(xué)實驗要求，可以用來進(jìn)行RT-PCR和Northern雜交。

本方法的優(yōu)點是先利用醋酸鉀(pH值4.8，5 mol·L－1)沉淀多糖，在較低的pH下，高濃度的K+有利于將多糖沉淀至下層，而RNA則保留在上層溶液，從而去除RNA中的部分多糖，并造成上層RNA液相中高濃度的 K+，有利于隨后氯仿抽提，進(jìn)一步去除RNA中的多糖成分。經(jīng)過以上2個步驟以后，RNA中的多糖成分可以被去除很大一部分，最后再通過 LiCl沉淀可以得到較高質(zhì)量和數(shù)量的RNA。在提取糖含量不同的果實RNA過程中，提取方法可以靈活變化，比如在對含糖量較低的桃和番茄果實RNA提取過程中，我們用醋酸鉀(pH值4.8，5 mol·L－1)沉淀多糖后，僅僅經(jīng)過1次氯仿抽提，然后LiCl沉淀，就可以得到較高質(zhì)量和數(shù)量的RNA。

然而，在提取含糖量較高的果實RNA的過程中，需要多步驟去除多糖，因此提取時間過長(15～19 h)是本方法的1個弱點，容易使得提取過程中的RNA降解，造成RNA提取的失敗。因此，在提取RNA過程中，應(yīng)該盡量使用0.1%DEPC處理過的塑料器皿和高溫烘烤過的玻璃器皿，以去除可能存在的RNase造成的影響。

總之，用本方法提取含糖量較高的果實總RNA，排除了多糖的干擾，取得良好的效果。所提RNA可以滿足分子生物學(xué)試驗操作，如RT-PCR和Northern雜交等，為我們進(jìn)一步研究富含多糖果實采后相關(guān)分子機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。

［1］Fang G，Hammar S，Grumet R A．Quick and inexpensive method for removing polysaccharides form plant genomic DNA［J］．Biotechniques，1992，13:52 －56．

［2］Hatzfeld W D，Stitt M．A study of the rate of recycling of triosphosphates in heterotrophic Chenopodium rubrum cells，potato tubers and maize endosperm［J］．Planta，1990，180:198－204．

［3］Geigenberger P，Stitt M A．Futile cycle of sucrose synthesis and degradation is involved in regulating partitioning between sucrose，starch and respiration in cotyledons of germinating RicinuscommunisL．seedlingswhen phloem transportis inhibited［J］．Planta，1991，185:81 －90．

［4］王貴禧，韓雅珊，于梁．獼猴桃軟化過程中階段性專一酶活性變化的研究［J］．植物學(xué)報，1995，37:198－203．