宋 杰，李 靜，胡陽黔，劉 堅，歐陽靜萍△

(1湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院，2湖北醫(yī)藥學院，湖北 十堰 442000;3武漢大學醫(yī)學院，湖北 武漢 430079)

2型糖尿病(diabetes mellitus，DM)和肥胖患者中存在脂代謝紊亂，甘油三酯、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FAs)和膽固醇均有升高。2001年美國糖尿病學會(ADA)年會上McGarry教授提出脂代謝障礙為DM及其并發(fā)癥的原發(fā)病理生理改變，同時提出可將2型DM稱作“糖脂病”，因此脂毒性理論越來越受到重視。脂毒性是指增高的循環(huán)游離脂肪酸濃度或增高的細胞內(nèi)脂質(zhì)含量的致糖尿病作用，骨骼肌是其主要作用部位之一［1］。本實驗室毛先晴等［2］的研究中表明，黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)“APS治療可明顯改善高脂飲食誘導的胰島素抵抗，而骨骼肌是胰島素抵抗發(fā)生的重要部位。本研究旨在FFAs對骨骼肌細胞的毒性以及應用中藥黃芪主要活性成分APS進行干預治療，探討APS對FFAs毒性的減輕作用及其可能機制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

C2C12成肌細胞(ATCC，批號 CRL－1771TM);低糖DMEM購自Sigma;胎牛血清購自Hyclone;優(yōu)化水煎工藝從膜莢黃芪(上海藥材公司)中提取APS(80～120 kD)(湖北中醫(yī)學院藥用植物鑒定教研室鑒定)，臨用前生理鹽水配成12%水溶液供實驗用［3］;MTT購自 Sigma;AMP活化蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)抗體購自Cell Sigaling Technology;磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK，p－AMPK)抗體和磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(phosphorylated acetyl－CoA carboxylase，p－ACC)抗體均購自Upstate;BCA Protein Assay Kit購自Pierce;蛋白內(nèi)參照采用 β－actin，購自Abcam;Protein Detector Western blotting Kit LumiGLO System購自KPL;5－氨基咪唑－4－甲酰胺－1－β－D－呋喃核糖苷(5－aminoimidazole－4－carboxamide－1－β－D－ribofuranoside，AICAR)購自Toronto Research Chemicals;長鏈游離脂肪酸(2/1 oleate/palmitate)購自Sigma，在37℃水浴中用少量無水乙醇溶解后加入已過濾除菌的5%(質(zhì)量分數(shù))牛血清白蛋白(第Ⅴ組分，不含游離脂肪酸)溶液，充分混勻后加入低糖DMEM培養(yǎng)液中，長鏈脂肪酸終濃度為0.25 mmol/L，其中油酸和軟脂酸的質(zhì)量比為2∶1，無水乙醇終濃度為0.5%(體積分數(shù))。

2 細胞傳代和培養(yǎng)

采用小鼠成肌細胞C2C12，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的低糖DMEM培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3 實驗分組

取對數(shù)生長期的細胞，倒出培養(yǎng)液，用無菌PBS沖洗3次，0.25%胰酶消化，然后計數(shù)每個培養(yǎng)瓶的細胞密度，以1×109/L轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)瓶，并如下分組:(1)對照組;(2)APS組;(3)AICAR組，AICAR為AMPK的特異性激動劑，此組作為AMPK活化的陽性對照組;(4)FFAs+APS組，經(jīng)FFAs(0.25 mmol/L)［4－5］處理 24 h 后換成 APS(200 mg/L)作用 24 h;(5)FFAs組，經(jīng) FFAs(0.25 mmol/L)處理 24 h 后換成生理鹽水(normal saline，NS)作用24 h(以與FFAs+APS對照)。

4 方法

4.1 MTT實驗 (1)取生長良好的細胞，以2×107/L細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每個實驗組種8孔，每孔接種100 μL，培養(yǎng)12 h細胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，按實驗分組加入相應培養(yǎng)液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)。(2)在24 h時點的前4 h各取培養(yǎng)板1塊，每孔加入5 mg/L MTT 50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液后向每孔加入20%DMSO 100μL，振蕩后在酶標儀上以490 nm波長測吸光度A值。

4.2 Werstern bloting檢測 將處理后的細胞，用PBS沖洗，冰上充分裂解后，置4℃超速離心機，離心，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒定量。煮沸5 min，SDS－PAGE分離蛋白后，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉2 h，漂洗后加入Ⅰ抗于4℃孵育過夜，漂洗后再加入辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔Ⅱ抗(1∶800稀釋，KPL)室溫孵育1 h，漂洗后ECL顯色，用高清晰度彩色病理細胞測量程序的圖形分析軟件系統(tǒng)測出相對吸光度值。

4.3 AMP/ATP比值測定 取上述分組細胞倒出培養(yǎng)液，用無菌PBS沖洗3次，用0.25%胰酶消化，用無藥物培養(yǎng)基吹打細胞，將細胞懸液1500 r/min離心10 min，棄去上清液再用PBS混懸漂洗2次，然后用0.5 mL蒸餾水將細胞沉淀混懸，移入1.0 mL勻漿器內(nèi)，勻漿5 min，勻漿液移入1.5 mL離心管中，5000 r/min離心10 min，取上清液200 μL置于 －80℃待高效液相色譜法分析。色譜條件:Dikma公司ODS－3反相柱(250×4.6 mm)，流動相為50 mmol/L磷酸鉀緩沖液，調(diào) pH至6.5，等比洗脫，流速1.2 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫20℃，進樣量20 μL。

4.4 透射電鏡 C2C12細胞分對照組、FFAs組和FFAs+APS組，F(xiàn)FAs處理24 h分別換成NS和APS繼續(xù)處理24 h，消化貼壁完好的C2C12細胞，用PBS洗2遍(離心、吹打，離心管內(nèi)完成)。然后轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管內(nèi)，用電鏡專用的戊二醛固定2.5 h。經(jīng)脫水、浸潤、包埋、切片后電鏡觀察。

5 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 APS與FFAs對C2C12細胞存活率的影響

APS處理24 h后，F(xiàn)FAs+APS組細胞存活率明顯高于FFAs組(P＜0.01)，見表1。

2 透射電鏡觀察

APS(200 mg/L)作用24 h，可顯著減輕FFAs導致的線粒體腫脹、嵴消失、空泡化等損傷，見圖1。

表1 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞活性的影響Table 1.The effects of APS and FFAs on viability of C2C12 cells(A..n=8)

表1 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞活性的影響Table 1.The effects of APS and FFAs on viability of C2C12 cells(A..n=8)

FFAs+APS:C2C12 cells were treated by FFAs for 24 h，and then treated by APS for another 24 h instead.＊＊P ＜0.01 vs control group;△P ＜0.05 vs FFAs group(24 h，48 h).

Group 0 h 24 h 48 h Control 0.832 ±0.015 0.821 ±0.024 0.805 ±0.044 APS 0.821 ±0.077 0.833 ±0.019 0.798 ±0.053 FFAs 0.825 ±0.077 0.414 ±0.040＊＊ 0.223 ±0.041 FFAs+APS 0.845 ±0.069 0.430 ±0.029＊＊ 0.701 ±0.050△AICAR 0.829 ±0.015 0.817 ±0.042 0.799 ±0.035

Figure 1.The C2C12 cell ultrastructure(×17000).A:control group;B:FFAs group;C:FFAs+APS group;D:AICAR group;E:APS group.FFAs:free fatty acids;APS:Astragalus polysaccharide;AICAR:5－aminoimidazole－4－carboxamide－1－β－D－ ribofuranoside.Arrows:vacuolar degeneration of mitochondria.圖1 C2C12細胞電鏡圖

3 AMPK、p－AMPK和p－ACC的表達

圖2顯示，總AMPK表達各組間無顯著差異(P＞0.05);FFAs組p－AMPK及p－ACC表達較對照組顯著降低(P＜0.01);而FFAs+APS組p－AMPK較FFAs組顯著增加(P＜0.01)，p－ACC表達較FFAs組顯著增加(P＜0.05)。

Figure 2.The expression of acetyl－CoA carboxylase(ACC)，phosphorylated ACC(p－ACC)，AMP－activated protein kinase(AMPK)and phosphorylated AMPK(p－AMPK)proteins..n=4.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs control group;*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs FFAs group.圖2 乙酰輔酶A羧化酶、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶、腺苷酸活化蛋白激酶和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶蛋白的表達

4 C2C12細胞內(nèi)AMP/ATP比值測定

表2顯示，與 FFAs組比較，F(xiàn)FAs+APS組C2C12細胞經(jīng)APS作用24 h后AMP/ATP比值顯著增大(P＜0.01)。

表2 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞AMP/ATP比值的影響Table 2.The effects of APS and FFAs on AMP/ATP ratio of C2C12 cells(.n=8)

表2 APS干預對FFAs損傷C2C12細胞AMP/ATP比值的影響Table 2.The effects of APS and FFAs on AMP/ATP ratio of C2C12 cells(.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs FFAs group.

Control APS FFAs FFAs+APS AICAR ATP(μmol/L)1.08±0.08 0.99±0.03 0.98±0.08 0.69±0.03 0.89±0.12 AMP(μmol/L)0.42±0.01 0.38±0.12 0.09±0.01 0.26±0.12 0.11±0.03 AMP/ATP 0.43±0.07 0.39±0.01 0.08±0.030.40 ±0.13＊＊0.07 ±0.02

討 論

胰島素抵抗是多種疾病發(fā)生的共同基礎(chǔ)，特別是肥胖、2型糖尿病、高血脂和高血壓等代謝綜合征［4］。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，無論是對STZ誘導的2型糖尿病動物模型，還是遺傳性2型糖尿病模型(KKAy小鼠)或胰島素抵抗模型，APS都具有增加胰島素敏感性、改善糖耐量，降低血糖和血脂、減少肝臟脂肪沉積以及減輕體重等作用［6－8］。

在本研究中，MTT實驗發(fā)現(xiàn)APS可以顯著提高經(jīng)高FFAs處理后的細胞的活性。由此證實，APS可以減輕高游離脂肪酸對骨骼肌細胞的毒性。

為進一步研究APS減輕FFAs細胞毒性的機制，我們通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，APS可一定程度修復FFAs損傷小鼠成肌細胞C2C12線粒體。該結(jié)論與岳曉莉等［9］研究中提出的“黃芪多糖能夠抑制線粒體膜電位崩解、保護線粒體形態(tài)”結(jié)論相似。

線粒體與能量代謝密切相關(guān)而AMPK是能量代謝的總開關(guān)。胰島素抵抗狀態(tài)下AMPK活性被抑制，AMPK的活化可以改善胰島素抵抗，降低甘油三酯和 FFAs含量，減輕脂毒性［10－11］。本實驗發(fā)現(xiàn)APS可以顯著增加 FFAs損傷 C2C12細胞中 p－AMPK(AMPK活化狀態(tài))表達及 p－ACC表達。ACC為脂肪酸氧化中的關(guān)鍵酶，p－ACC為ACC失活狀態(tài)，p－ACC增加可促進細胞脂肪酸氧化。這表明APS可以通過活化AMPK進而使ACC失活，促進細胞內(nèi)脂肪酸分解，減少脂肪酸蓄積，減輕高游離脂肪酸對細胞的毒性作用。

為進一步明確APS活化AMPK的機制，我們測定了AMP/ATP比值:與干預前相比，APS可以在干預24 h后增加細胞內(nèi)AMP/ATP比值。AMP/ATP比值增加，可以促進AMPK活化［12］。這可能與APS修復損傷線粒體有關(guān)。

綜上所述，APS可以減輕FFAs對骨骼肌細胞的毒性。本研究為APS成為減輕FFAs毒性、改善胰島素抵抗的藥物提供了理論基礎(chǔ)。

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