尹明景，溫漢春，葉永維，管慶林，黃皓章，黃露霜，朱繼金△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1急診科，2心血管病研究所，廣西 南寧 530021)

大量臨床與動物實驗資料表明高血壓、高血脂是人類動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的最主要危險因素，高鈉鹽高脂肪飲食則是被證明是最重要的導(dǎo)致血管粥樣硬化的環(huán)境因素［1－2］。CD40系統(tǒng)的相互作用作為炎癥信號的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展、變化的過程中發(fā)揮重要作用［3－4］。他汀類藥物被證明有穩(wěn)定AS的斑塊等多重效應(yīng)作用而廣泛使用于治療高膽固醇血癥和冠心?。?－6］。本研究通過利用高鹽和高脂肪攝入模擬導(dǎo)致動脈硬化的最重要的環(huán)境因素，觀察動脈血壓、血脂、血清可溶性 CD40配體(soluble CD40 ligand，sCD40L)濃度、動脈組織CD40/CD40L表達強度以及血管構(gòu)型參數(shù)變化情況和他汀類藥物對這一過程的影響，以探討動脈粥樣硬化及他汀類藥物的治療效果和機制。

材料和方法

1 試劑與主要設(shè)備

1.1 主要試劑 膽酸鈉片購于上海實業(yè)聯(lián)合集團長城藥業(yè)有限公司;膽固醇購于天津光夏精細化工研究所;維生素D3注射液購于浙江仙據(jù)制藥股份有限公司;辛伐他汀片購于江蘇黃河藥業(yè)股份有限公司;蘇木素購于福州邁新生物科技開發(fā)有限公司;油紅O購于上海銳聰科技發(fā)展有限公司;大鼠sCD40L ELISA試劑盒購于上海玉博生物科技有限公司;兔抗大鼠CD40L單克隆抗體購自上海玉博生物科技公司;羊抗兔辣根過氧化物酶標記Ⅱ抗購自上海玉博生物科技公司。

1.2 主要設(shè)備 鼠尾血壓計測量系統(tǒng)(北京奧爾森特科技有限公司);病理組織切片機(Leitz，1512型);Olympus Vanox顯微鏡照相系統(tǒng)(Optical Co.Ltd);圖像分析儀(Leica，DMR+0550型);貝克曼全自動生化儀與血液生化指標檢測(貝克曼庫爾特公司，廣西醫(yī)科大學(xué)一附院臨床檢驗中心完成);酶標儀(伯樂牌全自動酶標儀，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供)。

2 動物模型的建立

2.1 動物分組與飼養(yǎng) 雄性SD成年大鼠60只，體重200～250 g，清潔級，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物標準飼料喂養(yǎng)2周后按隨機分組法分為5組(n=12):正常對照組(normal，N組)、高脂攝入組(high fat group，F(xiàn) 組)、高鹽組(high salt group，S組)、高鹽高脂組(SF組)和高鹽高脂加辛伐他汀組(T組)。大鼠同置于相對恒溫(25℃)、恒濕(75%)房間，飲水、飼料不限，繼續(xù)喂養(yǎng)16周。飼料配方:N組:標準飼料，每100 g含食鹽0.4%;F組:標準飼料添加10%蛋黃粉、0.3%膽酸、5%豬油、1.2%膽固醇，在3 d內(nèi)腹腔注射7×105IU/kg的總劑量的維生素D3;S組:在標準飼料中加入4%的食用鹽;SF組:高脂配方中添加4%食用鹽;T組:高鹽與高脂飼料配方中加入辛伐他汀2 mg/kg。所有飼料由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心配制和提供。

2.2 血壓測量 動物飼養(yǎng)16周后，使用北京奧爾森特科技有限公司無創(chuàng)鼠尾血壓計測量系統(tǒng)，記錄每只大鼠鼠尾動脈血壓(收縮壓)，每只測4～6次，取平均值。

2.3 組織取材與數(shù)據(jù)的測量

檢測血壓后，10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，開腹后從下腔靜脈穿刺取血，離心分離血清，置于－20℃保存，用于檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)及sCD40L濃度。

剖開大鼠胸腔與腹腔，完整切取動脈瓣上主動脈起始部至髂動脈分叉處的主動脈，長度約3 cm左右。先取主動脈瓣上血管以10 μm厚度連續(xù)石蠟切片，取切片進行免疫組化染色、油紅O染色和常規(guī)蘇木精－伊紅染色。免疫組化染色圖片利用病理圖文分析系統(tǒng)進行形態(tài)參數(shù)和吸光度測量，顯示染色強度和含量，將結(jié)果按強陽性、弱陽性和陰性進行分級。油紅O染色顯示動脈組織脂肪浸潤情況;HE染色將動脈內(nèi)膜、中膜與外膜顯色清楚。將動脈環(huán)的切片置于顯微鏡下，放大倍數(shù)為40倍使之包括完整的動脈環(huán)并將圖像用攝影鏡頭傳輸?shù)轿C顯示屏上，鼠標描出動脈環(huán)的內(nèi)腔和外環(huán)(不包括外膜外的結(jié)締組織)的完整輪廓，用Leica分析軟件平面法，計算出血管內(nèi)腔面積和血管橫斷面積，并由此計算兩者的比值和中膜的厚度。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 實驗動物的情況

動物喂養(yǎng)期間，共喂養(yǎng)60只大鼠，存活55只，高鹽高脂組死亡3只，死于肺部感染;單純高脂組死亡1只，辛伐他汀干預(yù)組死亡1只，經(jīng)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病因。

2 各組大鼠干預(yù)后血壓與體重的變化

F組和SF大鼠體重明顯增加(P＜0.01)，而S組和T組與N組無明顯差異。S組與F組血壓均超過正常水平(P＜0.01)，SF組血壓增高更明顯(與F組或S組比，P＜0.01)。T組較 SF組血壓有所下降，但未能降至正常水平，與單一因素干預(yù)組無明顯差異，見表1。

3 各組大鼠血脂的變化

SF組TC和TG較其它組明顯升高(P＜0.01);F組TC和TG較N組亦明顯升高(P＜0.01);而S組TG未見明顯改變;N組與T組之間無明顯差異，見表2。

表1 各組大鼠收縮壓和體重Table 1.Systolic blood pressure(SBP)and body weight(BW)of rats in each group()

表1 各組大鼠收縮壓和體重Table 1.Systolic blood pressure(SBP)and body weight(BW)of rats in each group()

△△P ＜0.01 vs N group;##P ＜0.01 vs SF group.N:control;S:high salt;F:high fat;SF:high salt+high fat;T:high salt+high fat+simvastatin.

344.5 ±27.6 N 12 128.0 ±13.2 354.8 ±39.2 S 12 156.4 ±18.0△△## 361.1 ±25.6 F 10 148.9 ±27.3△△## 390.9 ±35.6△△SF 10 170.5 ±14.8△△ 412.3 ±45.6△△T 11 154.4 ±13.1△△

表2 各組大鼠血脂Table 2.Serum lipids in rats(mmol/L.)

表2 各組大鼠血脂Table 2.Serum lipids in rats(mmol/L.)

△△P ＜0.01 vs N group;＊＊P ＜0.01 vs SF group.

Total cholesterol Triglycerides Group n

4 各組大鼠血清sCD40L濃度

S組、F組和SF組血清sCD40L濃度高于N組和T組(P＜0.05);SF組血清sCD40L濃度高于S組和F組(P＜0.05);S組與F組間差異無顯著(P＞0.05);而N組與T組間差異亦無顯著(P＞0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清sCD40L濃度Table 3.The serum concentration of sCD40L(ng/L.)

表3 各組大鼠血清sCD40L濃度Table 3.The serum concentration of sCD40L(ng/L.)

△P ＜0.05 vs N group;#P ＜0.05 vs SF group.

N 12 2306.86 ±256.86 S 12 3271.24 ±282.11△#F 10 3452.69 ±320.79△#SF 10 4341.21 ±365.19△11 2279.40 ±299.75 T

5 動脈組織CD40/CD40L表達

免疫組化染色結(jié)果顯示，N組和T組無明顯著色，胞核清晰;S組和F組呈弱陽性，藍褐色較淡;SF組染色明顯加深，呈暗藍褐色，見圖1。

采用Kruskal－Wallis秩和檢驗對各組的陽性率進行比較，結(jié)果顯示升主動脈起始段動脈組織CD40/CD40L表達強度:S組、F組和SF組高于N組和T組(P＜0.05)，且SF組高于S組和F組(P＜0.05)，S組與F組、N組與T組間無明顯差異(P＞0.05)，見表 4。

Figure 1.Immunohistochemical staining of CD40/CD40L(×100).A:control group;B:high salt group;C:high fat group;D:high fat+high salt group;E:high salt+high fat+simvastatin group.圖1 各組免疫組化染色結(jié)果

表4 各組大鼠動脈組織CD40/CD40L表達強度Table 4.CD40/CD40L expression in arterial tissues

6 各組大鼠動脈構(gòu)型的變化

各組大鼠動脈構(gòu)型的變化與N組相比，S組動脈中膜明顯增厚，但血管內(nèi)膜完整，管壁厚度均勻一致，血管內(nèi)腔面積和血管橫斷面積均增加;高脂組攝入也存在類似改變，但管壁厚薄不均，有明顯斑塊形成，形態(tài)不規(guī)則，蘇木素－油紅O染色在高倍鏡下為紫紅色中膜層見桔紅色的脂肪浸潤，血管內(nèi)腔明顯變窄;SF組的這種改變更為明顯，且使血管內(nèi)腔面積與血管橫斷面積的比值明顯縮小;而辛伐他汀治療組未見明顯動脈粥樣硬化斑塊和脂肪浸潤，僅表現(xiàn)為中膜增厚，見表 5、圖 2、3。

Figure 2.Configurational changes of aorta(HE staining，×40).A:control group;B:high salt group;C:high fat group;D:high fat+high salt group;E:high salt+high fat+simvastatin group.圖2 各組大鼠動脈構(gòu)型變化

Figure 3.Configurational changes of aorta(oil red O staining，×100).A:control group;B:high salt group;C:high fat group;D:high fat+high salt group;E:simvastatin group.圖3 各組大鼠動脈構(gòu)型變化

表5 各組大鼠血管構(gòu)型數(shù)值變化表Table 5.Vessel configuration values in each group()

表5 各組大鼠血管構(gòu)型數(shù)值變化表Table 5.Vessel configuration values in each group()

△△P ＜0.01 vs N group;#P ＜0.05 vs N group.MT:medium thickness;LA:lumen area;TVA:total vascular area.

Group MT(μm) LA(mm2) TVA(mm2) LA/TVA(%)N 93.81 ±10.48 2.63±0.58 3.31±0.59 79.30 ±5.52 S 135.28±12.29△△ 2.75±0.52 3.59±0.47# 72.90±4.90#F 158.86±15.23△△ 2.58±0.63 3.52±0.72# 70.00±6.77#SF 184.00±13.40△△ 2.87±0.41 4.33±0.60△△ 66.70±6.91△△T 112.60 ±15.73 2.87±0.48 3.80±0.58# 74.50 ±7.26#

討 論

本研究通過高脂和高鈉鹽攝入干預(yù)普通SD大鼠16周后，高鹽組或高脂組的大鼠血壓明顯高于正常組，動脈結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯增厚甚至粥樣硬化等病理變化，這種異常現(xiàn)象在高鈉鹽與高脂肪復(fù)合喂養(yǎng)組大鼠比任何單一因素喂養(yǎng)顯著，而且血脂增高與血壓呈正相關(guān)，提示高脂可能有加重高鹽飲食所致大鼠動脈血壓效應(yīng)，兩種因素在誘發(fā)血管病變方面可能有協(xié)同作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)高鹽喂養(yǎng)大鼠發(fā)生動脈中膜增厚明顯但均勻一致、血管內(nèi)膜完整，血管和管腔面積均增加，血管橫斷面積和血管內(nèi)腔面積均有明顯的增大，但由于在中膜增厚的情況下，血管內(nèi)腔面積/血管橫斷面積比例較正常變小，存在著所謂外向型重構(gòu)現(xiàn)象，但未出現(xiàn)典型的動脈粥樣硬化斑塊，提示血管壁平滑肌增生導(dǎo)致中膜增厚和功能異常改變可能是高鈉鹽誘發(fā)高血壓關(guān)鍵環(huán)節(jié)。另一方面，本研究中發(fā)現(xiàn)高脂飲食亦誘發(fā)大鼠血壓升高，但其主動脈構(gòu)型變化與高鹽攝入組不同，動脈中膜明顯增厚但很不均勻且出現(xiàn)典型的動脈粥樣斑塊，油紅O染色發(fā)現(xiàn)其動脈管壁存在典型脂肪浸潤，其血管內(nèi)腔面積/血管橫斷面積比減少更明顯，同時發(fā)現(xiàn)高鹽高脂復(fù)合干預(yù)的大鼠，其動脈中膜厚度明顯高于正常組與任何單一因素干預(yù)組，動脈粥樣硬化改變也更加顯著，提示高鹽與高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致的血管構(gòu)型改變更加嚴重。根據(jù)上述研究表明，高鹽高脂復(fù)合飲食較任何單一因素均能明顯改變動脈構(gòu)型，高鹽飲食對動脈粥樣硬化過程存在明顯強化作用。

流行病學(xué)證實長期高鹽飲食與一些人群動脈血壓升高有一定關(guān)系，其機制可能是由于鈉潴留使細胞外液容量增加，因此心排血量增加;血管平滑肌細胞內(nèi)鈉水平增高又導(dǎo)致細胞內(nèi)鈉離子濃度升高，并使血管收縮反應(yīng)增強，因此外周血管阻力升高;高鹽攝入甚至可以損害血管內(nèi)皮功能和腎臟功能，這些均可促進高血壓的形成［7－8］。而高血壓又是AS重要的危險因素，過高的血管壁壓力通過機械和化學(xué)雙重刺激損傷內(nèi)皮細胞，加上血流對血管壁的沖擊會損害血管內(nèi)膜，內(nèi)皮的功能受到損傷后，血液中的脂質(zhì)更加容易沉積在血管壁，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，促進血管中膜平滑肌層向內(nèi)膜遷移，后者合成膠原和細胞外基質(zhì)并發(fā)生自身增殖，同時分泌并激活多種細胞因子吸引循環(huán)中的單核細胞黏附聚集，遷入內(nèi)膜下轉(zhuǎn)化為巨噬細胞 ，后者與SMCs在內(nèi)膜下吞噬脂質(zhì)形成泡沫細胞，加速斑塊的形成和內(nèi)膜與中膜的增厚［9－10］。高脂肪攝入可以導(dǎo)致血脂增高、損傷動脈內(nèi)膜，導(dǎo)致動脈硬化與血管重構(gòu)，目前公認的機制之一是高膽固醇中富集的氧化修飾LDL(oxLDL)在動脈內(nèi)膜受損情況下進入內(nèi)膜下中層，吸附血液中的單核細胞遷入動脈內(nèi)膜并轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?1－12］。在合并高血壓情況下，二者互相促進，明顯加劇動脈粥樣硬化的形成。而發(fā)生了動脈粥樣硬化的血管正常舒張功能減弱，血管壁的僵硬度增加，血壓又會升高，二者之間互為因果，形成惡性循環(huán)。

本實驗還通過辛伐他汀藥物干預(yù)高鹽高脂復(fù)合喂養(yǎng)的大鼠，其動脈中膜較正常組輕度增厚，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其血管內(nèi)腔面積/血管橫斷面積比較正常組也無明顯改變，表明他汀類藥物在逆轉(zhuǎn)動脈斑塊與改善血管重構(gòu)的明顯作用。大量實驗研究和大規(guī)模臨床試驗也顯示他汀類藥物不僅具有調(diào)脂作用，還具有很多獨立于其調(diào)脂作用的效果，即他汀類藥物的多效性，如改善血管內(nèi)皮功能、抑制炎癥及抗氧化反應(yīng)、抗血小板聚集和抑制血栓形成、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊、抑制心肌重塑及心肌細胞凋亡、抑制心臟電生理重塑及調(diào)節(jié)心臟植物神經(jīng)功能等一系列降脂外作用［13－15］。

研究證實動脈粥樣硬化是一種有免疫系統(tǒng)參與的慢性炎癥，CD40和CD40配體系統(tǒng)作為重要的炎癥信號通路是動脈粥樣硬化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與斑塊的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［16］。本實驗通過觀察血清sCD40L表達水平的變化，作為觀察炎癥的指標。發(fā)現(xiàn)高鹽組、高脂組、高鹽高脂組血清sCD40L表達水平較正常組和治療組明顯升高，高鹽高脂組sCD40L表達水平較高鹽組和高脂組又明顯升高，辛伐他汀治療組與正常組間無明顯差異，免疫組化檢測各組大鼠升主動脈起始段動脈組織CD40/CD40L表達強度的差異亦與血清sCD40L表達水平差異類似。表明他汀類藥物可通過抑制CD40/CD40L途徑來保護動脈組織。隨著他汀類藥物作用機制的逐漸明朗和越來越多的循證醫(yī)學(xué)支持，他汀類藥物的應(yīng)用前景將更加廣泛。

以上研究表明，在較短時間予高鹽高脂飲食可以誘導(dǎo)大鼠血壓升高、血脂異常與動脈粥樣硬化形成，建立類似代謝異常所致的高血壓與動脈粥樣硬化模型，他汀類藥物不但具有降脂作用，對大鼠主動脈重構(gòu)有明顯抑制作用，提示他汀類藥物在防治動脈粥樣硬化和治療代謝綜合征方面有重要的作用。

［1］Appel LJ，F(xiàn)rohlich ED，Hall JE，et al.The importance of population－wide sodium reduction as a means to prevent cardiovascular disease and stroke:a call to action from the American Heart Association［J］.Circulation，2011，123(10):1138－1143.

［2］Sniderman AD，Williams K，Contois JH，et al.A metaanalysis of low －density lipoprotein cholesterol，non－h(huán)igh－ density lipoprotein cholesterol，and apolipoprotein B as markers of cardiovascular risk［J］.Circ Cardiovasc Qual Outcomes，2011，4(3):337－345.

［3］程 軍，李金平，田 卓，等.南蛇藤素對ApoE基因敲除小鼠主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)CD40配體表達、巨噬細胞和平滑肌細胞數(shù)量的影響［J］.中國病理生理雜志，2009，25(3):601－603.

［4］彭朝權(quán)，李翠芝，鄒麗媛.可溶性CD40L在評價冠狀動脈粥樣硬化斑塊易損傷中的意義［J］.中國病理生理雜志，2008，24(10):1948－1952.

［5］Expert pannel on Detection，Evaluation and Treatment of High Blood cholesterol in Adults.Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection，Evaluation，and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults(Adult Treatment Panel III)［J］.JAMA，2001，285(19):2486－2497.

［6］Randomised trial of cholesterol lowering in 4444 patients with coronary heart disease:the Scandinavian Simvastatin Survival Study(4S)［J］.Lancet，1994，344(8934):1383－1389.

［7］Blaustein MP，Zhang J，Chen L，et al.How does salt retention raise blood pressure?［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2006，290(3):R514 － R523.

［8］Liu Z.Dietary sodium and the incidence of hypertension in the Chinese population:a review of nationwide surveys［J］.Am J Hypertens，2009，22(9):929 －933.

［9］Ferrario CM，Smith R，Levy P，et al.The hypertensionlipid connection:insights into the relation between angiotensin II and cholesterol in atherogenesis［J］.Am J Med Sci，2002，323(1):17 －24.

［10］Rosendorff C，Black HR，Cannon CP，et al.Treatment of hypertension in the prevention and management of ischemic heart disease:a scientific statement from the American Heart Association Council for High Blood Pressure Research and the Councils on Clinical Cardiology and Epidemiology and Prevention ［J］.Circulation，2007，115(21):2761－2788.

［11］Tsimikas S，Brilakis ES，Miller ER，et al.Oxidized phospholipids，Lp(a)lipoprotein，and coronary artery disease［J］.N Engl J Med，2005，353(1):46－57.

［12］Kathiresan S.Lp(a)lipoprotein redux－from curious molecule to causal risk factor［J］.N Engl J Med，2009，361(26):2573－2574.

［13］Moreno PR，Purushothaman KR，Sirol M，et al.Neovascularization in human atherosclerosis［J］.Circulation，2006，113(18):2245－2252.

［14］Murphy SA，Cannon CP，Wiviott SD，et al.Reduction in recurrent cardiovascular events with intensive lipid－lowering statin therapy compared with moderate lipid－lowering statin therapy after acute coronary syndromes from the PROVE IT－TIMI 22(Pravastatin or Atorvastatin Evaluation and Infection Therapy－Thrombolysis In Myocardial Infarction 22)trial［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54(25):2358－2362.

［15］LaRosa JC，Grundy SM，Waters DD，et al.Intensive lipid lowering with atorvastatin in patients with stable coronary disease［J］.N Engl J Med，2005，352(14):1425－1435.

［16］嚴金川，吳宗貴，仲人前，等.CD40－CD40L共同表達于人內(nèi)皮細胞及人動脈粥樣斑塊中［J］.中國病理生理雜志，2002，19(8):1021－1024.