韓 瑞，周 燕，王舒陽，張廣宇，彭 越，王翠琴，魯晶晶，彭 濤，賈延劼△

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院1神經(jīng)內(nèi)科，2放射科，河南 鄭州 450052)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有多向分化潛能的多能成體干細(xì)胞，可以向神經(jīng)細(xì)胞分化［1－2］。誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞，有可能在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和修復(fù)中提供新的可行性方法，但MSCs的分化機(jī)制及影響因素等問題研究尚不清楚［3－4］。Kamiya 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白521(zinc finger protein 521，Zfp521)是胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化的關(guān)鍵因子之一，其作為早期的神經(jīng)核蛋白，在胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮重要的激活和促進(jìn)作用。Zfp521能否在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)，及Zfp521是否在MSCs的神經(jīng)分化過程中發(fā)揮作用尚未有報道。本研究通過體外誘導(dǎo)大鼠MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞，觀察Zfp521在MSCs的表達(dá)情況及誘導(dǎo)前、后Zfp521的表達(dá)變化，探討Zfp521在MSCs神經(jīng)分化中的作用及意義。

材料和方法

1 動物

SPF級Wistar大鼠，鼠齡8～12周，雌雄不限，體質(zhì)量150～200 g，由河南省實(shí)驗動物中心提供，許可證號為SCXK(豫)2005－0001。常規(guī)從大鼠股骨中分離提取MSCs［6］，連續(xù)傳代10代以上的細(xì)胞置于液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco;神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron－specific enolase，NSE，sc－15343)、微管相關(guān)蛋白2(microtubule－associated protein 2，MAP－2，sc－20172)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，sc － 9065)、Zfp521(sc－84808)兔抗多克隆抗體均購自 Santa Cruz;Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購自上海碧云天公司;AEC顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司;大鼠Rn－Zfp521－siRNA(SI01690976)、陰性對照 siRNA、轉(zhuǎn)染試劑 HiPerFect、RNeasy Mini試劑盒、QIAGEN? OneStep RT－PCR試劑盒均為Qiagen產(chǎn)品;凝聚胺、多聚賴氨酸購自Sigma;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海生工基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗分組 取培養(yǎng)第10代以上的MSCs復(fù)蘇，按照2×106cells/well的比例接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率為50% ～70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染不同，選擇同時點(diǎn)同一培養(yǎng)板MSCs隨機(jī)分為3組:未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染Rn－Zfp521－siRNA)和陰性對照組(轉(zhuǎn)染negative control siRNA)。

表1 引物序列Table 1.Primer sequence

3.2 大鼠MSCs轉(zhuǎn)染 按照Qiagen公司的操作說明書，細(xì)胞融合度達(dá)50% ～70%時，每孔加入1.1 mL完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+青、鏈霉素)，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。同時，分別取300 ng siRNA(Rn－Zfp521－siRNA、negative control siRNA)，溶于 100 μL DMEM 培養(yǎng)基中，再加入HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑6 μL，混勻，室溫孵育10 min后，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物均勻滴入含MSCs的孔內(nèi)，使siRNA終濃度達(dá)到20 nmol/L，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。未轉(zhuǎn)染組MSCs不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其它培養(yǎng)條件同各轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察Alexa Fluor 488標(biāo)記的轉(zhuǎn)染組、Cy3標(biāo)記的陰性對照組MSCs熒光表達(dá)情況，評價細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。RT－PCR法進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)染后各組MSCs中Zfp521表達(dá)變化。

3.3 體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞 參照我們的方法［7］，待培養(yǎng)孔板內(nèi)細(xì)胞融合率達(dá)50% ～70%，取誘導(dǎo)組進(jìn)行誘導(dǎo)。去除DMEM完全培養(yǎng)基，DHanks液清洗3次，加入預(yù)誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1 mmol/L β－巰基乙醇)置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。預(yù)誘導(dǎo)后，去除預(yù)誘導(dǎo)液，加入誘導(dǎo)液(DMEM培養(yǎng)基，10 mmol/L β－巰基乙醇)，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)5 h。

3.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法 將各組細(xì)胞用PBS清洗之后，迅速經(jīng)4%多聚甲醛、4℃固定過夜，0.2%Triton X－100處理10 min，并用封閉液封閉1 h。然后分別用 NSE 抗體(1.0 mg/L)、MAP－2抗體(1.0 mg/L)、GFAP 抗體(1.0 mg/L)及 Zfp521 抗體(1.0 mg/L)4℃孵育24 h。用PBS洗3遍后，用Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶200)或AEC顯色試劑盒在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記、觀察。細(xì)胞圖像通過顯微鏡用×20攝取。每組獨(dú)立的實(shí)驗都會采集超過30個區(qū)域的細(xì)胞。而且，在明視野下所采集的每幅圖像都盡量包含相同的細(xì)胞數(shù)目。采用雙人雙盲隨機(jī)記數(shù)陽性細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞百分比例。

3.5 Western blotting 分別收集各組細(xì)胞，PBS液漂洗1遍，按照1×106加入100 μL雙去污裂解液(10 mmol/L pH 6.8 Tris － H Cl，1%SDS，1%TritonX－100，100 mg/L PMSF，100 mg/L 抑肽酶)的比例充分裂解細(xì)胞，4℃ 12000 r/min離心10min，保留上清，－80℃貯存?zhèn)溆?，以BCA法測定總蛋白濃度。SDS－PAGE采用5%濃縮膠、8%分離膠，上樣量為100 μg，電壓90V恒壓18 min跑到濃縮分離交界處，更改電壓為120V，繼續(xù)電泳55min。電泳結(jié)束后取出凝膠轉(zhuǎn)移至同等大小的硝酸纖維素膜上。轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜置于封閉液(含5%脫脂奶粉的TBST溶液)4℃過夜，加入兔抗Zfp521多克隆抗體(1∶200)，室溫處理2 h，TBST 漂洗10 min×3 次;辣根過氧化物酶聯(lián)抗兔IgG(1∶5000)室溫處理2 h，PBST漂洗10 min×3次;ECL顯色液中反應(yīng)至條帶清晰。

3.6 RT－PCR 采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細(xì)胞的總RNA，分光光度法測定并計算提取的總RNA含量及濃度。參照Qiagen? OneStep RT－PCR試劑盒實(shí)驗操作說明進(jìn)行RT－PCR，總反應(yīng)體積 50.0 μL，其中 5 × Qiagen OneStep RT － PCR Buffer 10.0 μL，dNTP Mix 2.0 μL，Qiagen OneStep RT－ PCR Enzyme Mix 2.0 μL，5 × Q － Solution 10.0 μL，RNase inhibitor 10 U，RNA 1.0 μg，引物 0.6 μmol/L。擴(kuò)增條件為:50℃逆轉(zhuǎn)錄30min，95℃ 15 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30～35個循環(huán)，72℃ 10 min。GAPDH擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性1 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 10 min。然后，取 RT －PCR 產(chǎn)物10.0 μL，加上樣緩沖液 2.0 μL，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，70 V 40 min，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實(shí)驗結(jié)果，凝膠圖像分析系統(tǒng)(GelPro Analyzer 3.0)分析，計算待測基因與內(nèi)參照GAPDH平均灰度值的比值，比較各組間待測基因/GAPDH比值的大小。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠MSCs轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞形態(tài)變化不顯著，僅見少數(shù)細(xì)胞脫落、胞體收縮呈球形或梭形。轉(zhuǎn)染組和陰性對照組轉(zhuǎn)染72 h后熒光表達(dá)最強(qiáng)，陰性對照組評價轉(zhuǎn)染效率為83.5% ±2.6%，轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率為84.1%±2.3%，見圖1。RT－PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組Zfp521表達(dá)較未轉(zhuǎn)染組及對照組減少(P＜0.05)，見圖2。

Figure 1.Alexa Fluor 488－labeled transfected group and Cy3－labeled negative control group(72 h after transfection，×200).A，B:transfection group;C，D:negative control group.A，C:inverted microscope;B，D:fluorescent microscope.圖1 Alexa Fluor 488標(biāo)記的轉(zhuǎn)染組和Cy3標(biāo)記的陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染

Figure 2.The expression of Zfp521 mRNA 72 h after transfection.1:non － transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜ 0.05 vs other groups.圖2 轉(zhuǎn)染72 h后Zfp521 mRNA的表達(dá)

2 β－巰基乙醇體外誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 誘導(dǎo)2 h后各組MSCs開始出現(xiàn)少數(shù)細(xì)胞胞體收縮呈圓形、錐形，細(xì)胞突起細(xì)長，誘導(dǎo)5h后，多數(shù)細(xì)胞胞體收縮呈圓形、錐形，細(xì)胞突起細(xì)長，交織成網(wǎng)，形成較典型的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)。少量細(xì)胞脫落、死亡。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化更加明顯，未轉(zhuǎn)染組和對照組類似。

2.2 誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞鑒定 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組 NSE、MAP－2的陽性細(xì)胞比率分別為83.6% ±1.4%，85.4% ±1.2%，顯著高于未轉(zhuǎn)染組和對照組(P＜0.05)，但各組GFAP表達(dá)率均小于1%，見圖3、表 2。Western blotting結(jié)果顯示 NSE、MAP－2蛋白表達(dá)高于其它2組(P＜0.05)，見圖4。RT－PCR顯示轉(zhuǎn)染組 NSE mRNA、MAP－2 mRNA表達(dá)顯著高于其它2組(P＜0.05)，見圖5。

3 Zfp521在MSCs中表達(dá)及神經(jīng)分化中的變化

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Zfp521在各組MSCs均有表達(dá)，誘導(dǎo)5 h后各組Zfp521表達(dá)均明顯下降，差異顯著(P＜0.01)，見圖6、表3。Western blotting結(jié)果顯示，蛋白大小為148 kD處可見Zfp521蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)5 h后Zfp521表達(dá)量顯著下降(P＜0.01)，見圖7。RT－PCR顯示誘導(dǎo)5 h后MSCs Zfp521 mRNA表達(dá)顯著低于MSCs(P＜0.01)，見圖8。

Figure 3.The expression of NSE and MAP －2 in β －mercaptoethanol－induced differentiation of MSCs into neurons 5 h after induction(×200).A，B，C:the expression of NSE;D，E，F(xiàn):the expression of MAP －2;A，D:non－transfection group;B，E:transfection group;C，F(xiàn):negative control group.圖3 β－巰基乙醇誘導(dǎo)各組MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞后NSE和MAP－2的表達(dá)

表2 β－巰基乙醇誘導(dǎo)5 h各組NSE和MAP－2的表達(dá)Table 2.The expression of NSE and MAP－25 h after induction by β－mercaptoethanol(%..n=10)

表2 β－巰基乙醇誘導(dǎo)5 h各組NSE和MAP－2的表達(dá)Table 2.The expression of NSE and MAP－25 h after induction by β－mercaptoethanol(%..n=10)

*P ＜0.05 vs other groups.

Group NSE MAP－2 GFAP Non－transfection 75.7 ±1.0 78.4 ±1.8 ＜1 Transfection 83.6 ±1.4* 85.4 ±1.2* ＜1 Negative control 74.3 ±0.9 77.1 ±1.5 ＜1

Figure 4.The expression of NSE and MAP－2 proteins 5 h after induction.1:non － transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜ 0.05 vs other groups.圖4 NSE和MAP－2蛋白的表達(dá)

Figure 5.The expression of NSE and MAP－2 mRNA 5 h after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P＜0.05 vs other groups.圖5 NSE和MAP－2 mRNA的表達(dá)

討 論

Figure 6.The expression of Zfp521 before and after induction(×200).A，B，C:before induction;D，E，F(xiàn):after induction;A，D:non － transfection group;B，E:transfection group;C，F(xiàn):negative control group.圖6 誘導(dǎo)前后Zfp521的表達(dá)

表3 各組細(xì)胞誘導(dǎo)前后Zfp521的表達(dá)Table 3.The expression of zfp521 in each group before and after induction(%..n=10)

表3 各組細(xì)胞誘導(dǎo)前后Zfp521的表達(dá)Table 3.The expression of zfp521 in each group before and after induction(%..n=10)

＊＊P ＜0.01 vs before induction.

Group Before induction After induction Non － transfection 88.9 ±2.0 38.4 ±1.5＊＊Transfection 75.2 ±1.4 29.3 ±1.8＊＊Negative control 85.6 ±1.9 38.6 ±1.3＊＊

Zfp521屬于C2H2型家族鋅指蛋白，由1311個氨基酸序列組成，其內(nèi)穿插著30個Krüppel樣鋅指結(jié)構(gòu)域，在氨基酸末端，一種13－A元件連接到核重塑和組蛋白去乙?；瘡?fù)合物(nucleosome remodelling and histone deacetylase，NuRD)中并在幾個轉(zhuǎn)錄共抑制物中相對保守［8－10］。Zfp521廣泛存在于肌肉、心臟、脾、胰、腎、淋巴結(jié)、胸腺及胎兒肝組織，在腦組織內(nèi)Zfp521含量也十分豐富，尤其在小腦［11－13］。它在鼠的類同源物，Evi/Zfp521，在造血祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、小腦顆粒層原始神經(jīng)細(xì)胞及發(fā)育中的紋狀體中含量均為豐富［9］，Zfp521在發(fā)育中及成熟神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)提示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的個體發(fā)育及特殊功能調(diào)節(jié)方面發(fā)揮了重要作用［14］。但 Zfp521在MSCs中是否表達(dá)尚未有報道，本研究通過對兩組細(xì)胞中Zfp521表達(dá)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)大鼠MSCs可表達(dá) Zfp521，且表達(dá)率可達(dá) 88.9% ±2.0%，提示Zfp521在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)育和維持上發(fā)揮了重要作用。

Figure 7.The expression of Zfp521 protein before and after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜0.05 vs before induction.圖7 誘導(dǎo)前后Zfp521蛋白的表達(dá)

Figure 8.The expression of Zfp521 mRNA before and after induction..n=10.1:non－transfection group;2:transfection group;3:negative control group.*P ＜0.05 vs before induction.圖8 誘導(dǎo)前后Zfp521 mRNA的表達(dá)

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Zfp521作為轉(zhuǎn)錄因子，不僅可以特異性結(jié)合DNA和RNA，還能與DNA－RNA雜交雙鏈分子以及其它鋅指蛋白或自身結(jié)合，與基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、干細(xì)胞調(diào)節(jié)及腫瘤形成有密切關(guān)系［8］。Kamiya 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎干細(xì)胞中，Zfp521作為早期的神經(jīng)核蛋白，具有有效的神經(jīng)分化激活作用，尤其在促進(jìn)外胚層祖細(xì)胞向神經(jīng)外胚層轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要激活作用，通過建立的過表達(dá)Zfp521模型中，發(fā)現(xiàn)Sox1、Sox3及Pax6基因表達(dá)增加，而Oct6或Fgf5基因表達(dá)未有增加，提示Zfp521在促進(jìn)干細(xì)胞神經(jīng)分化中是通過激活早期神經(jīng)外胚層基因，而不是抑制非神經(jīng)相關(guān)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)［5］，在神經(jīng)分化抑制因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic proteins 4，BMP4)存在狀態(tài)下，強(qiáng)制表達(dá)Zfp521也可使胚胎干細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)分化。Zfp521可與其共激活物 p300(p300 coactivator)結(jié)合，激活早期神經(jīng)相關(guān)基因，處于外胚層狀態(tài)的胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)外胚層祖細(xì)胞，進(jìn)而分化為神經(jīng)祖細(xì)胞，也可通過減少神經(jīng)相關(guān)抑制因子促進(jìn)神經(jīng)分化。研究發(fā)現(xiàn)，在一些未成熟細(xì)胞的分化過程中Zfp521的表達(dá)量逐漸下降［15］。但在骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化過程中Zfp521的表達(dá)變化尚未有報道。本研究通過檢測MSCs誘導(dǎo)分化前后兩組細(xì)胞Zfp521的表達(dá)量，免疫組織化學(xué)法檢測誘導(dǎo)前MSCs中Zfp521表達(dá)率為88.9% ±2.0%，分化為神經(jīng)細(xì)胞后Zfp521的表達(dá)明顯下降，表達(dá)率為38.4% ±1.5%，抑制Zfp521表達(dá)可提高M(jìn)SCs的神經(jīng)分化效率，RT－PCR及Western blotting法檢測顯示有同樣的結(jié)果，提示Zfp521在MSCs的神經(jīng)分化過程中可能發(fā)揮了重要調(diào)控作用。其可能的作用機(jī)制為:一方面，Zfp521可能通過其N－端13－AA基序連接到NuRD復(fù)合物，募集NuRD蛋白，并與其它轉(zhuǎn)錄因子反應(yīng)，作用于靶基因，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因的表達(dá)［13］。另一方面，Zfp521是骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的一個分子，BMP通路在細(xì)胞分化、發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［8，16］，在 BMP2 和 BMP4 途徑中，Zfp521 與轉(zhuǎn)錄因子SMAD－1、SMAD－4結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞核作用于靶基因，對干細(xì)胞增殖及分化發(fā)揮重要的調(diào)控作用［16］。抑制Zfp521可能減弱了BMP的抑制作用，從而促進(jìn)神經(jīng)分化。

綜上所述，通過本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中Zfp521表達(dá)量較高，誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞后，Zfp521表達(dá)量明顯下降，抑制Zfp521可促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化，提示Zfp521在MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。但Zfp521在MSCs神經(jīng)分化過程中具體作用機(jī)制尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。

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