萬克強(qiáng)， 廖俊蕾， 趙 蕾， 李 青， 陳壓西， 阮雄中

(重慶醫(yī)科大學(xué)脂糖代謝性疾病重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，教育部感染性疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016)

慢性腎臟疾病患者往往有不同程度的脂質(zhì)代謝紊亂，它既是許多原發(fā)或繼發(fā)性腎臟疾病的常見臨床表現(xiàn)，又參與了腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，在腎臟疾病早期就會(huì)有血清游離脂肪酸(free fattyacid，F(xiàn)FA)增高。腎臟是FFA重要的代謝器官，也是脂肪酸β氧化產(chǎn)生能量的主要場所。脂肪酸在腎臟細(xì)胞的異常跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)慢性腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展起了不可忽視的作用。隨著慢性腎臟疾病的發(fā)展，機(jī)體往往出現(xiàn)全身持續(xù)低度的炎癥反應(yīng)，而炎癥可進(jìn)一步加重腎臟損害的進(jìn)程。近來研究表明，炎癥可以通過干擾介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡的一些分子表達(dá)，改變脂質(zhì)在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和分布，導(dǎo)致脂質(zhì)過多地沉積在組織細(xì)胞內(nèi)，造成組織器官損害［1－3］。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(fatty acid transporter，F(xiàn)AT/CD36)在調(diào)節(jié)脂肪酸在腎臟的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起到重要作用。正常狀態(tài)下，F(xiàn)AT/CD36作為B類清道夫受體在巨噬細(xì)胞有一定表達(dá)，而有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠巨噬細(xì)胞CD36表達(dá)較正常組增加［4］，則提示與一些病理改變有關(guān)。炎癥是否能干擾腎細(xì)胞FAT/CD36表達(dá)而進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟細(xì)胞脂肪酸代謝紊亂卻鮮見報(bào)道。因此本研究旨在應(yīng)用人系膜細(xì)胞(human mesangial cells，HMCs)和腎小管上皮細(xì)胞HK－2作為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停醪接^察在炎癥和脂肪酸負(fù)荷狀態(tài)下腎細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá)以及胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚情況。

材料和方法

1 材料

改良型 RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hy-Clone);軟脂酸、油紅O(Sigma);腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF－α)(PeproTech Asia);白細(xì)胞介素6(interleukin－6，IL－6)(SinoBio);Trizol RNA提取劑、PrimeScript? RT reagent kit和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa);細(xì)胞總蛋白提取試劑盒(Keygen);PCR引物通過TaqMan Primer Express軟件設(shè)計(jì)，上海生物工程公司合成;β－actin兔單抗IgG、FAT/CD36兔單抗IgG和goat anti－rabbit IgG－HRP(Santa Cruz)。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HMCs用含10%胎牛血清及1%胰島素－轉(zhuǎn)鐵蛋白－亞硒酸鈉(insulin－transferrinsodium selenite，ITS)的改良型 RPMI－1640培養(yǎng)基，HK－2細(xì)胞用含10%胎牛血清的改良型RPMI－1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，1～2 d換液，3～4 d傳代。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將匯合度達(dá)90%的HMCs和HK－2細(xì)胞更換無脂肪酸培養(yǎng)基RPMI－1640+0.2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)培養(yǎng)24 h，將不同濃度軟脂酸(0 mmol/L、0.02 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.32 mmol/L)處理 HMCs和 HK－2細(xì)胞 24 h，觀察 FAT/CD36 mRNA和蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步選取軟脂酸0.04 mnol/L，再聯(lián)合炎癥因子處理細(xì)胞，分為6組:(1)對(duì)照組 (control):RPMI－1640+0.2%BSA;(2)軟脂酸組 (palmitate):RPMI－1640+0.2%BSA+0.04 mmol/L軟脂酸;(3)TNF－α組:RPMI－1640+0.2%BSA+25 μg/L TNF－α;(4)IL－6組:RPMI－1640+0.2%BSA+20 μg/L IL－6;(5)軟脂酸聯(lián)合TNF－α組(palmitate+TNF－α):RPMI－1640+0.2%BSA+0.04 mmol/L palmitate+25 μg/L TNF－α;(6)軟脂酸聯(lián)合IL－6組(palmitate+IL－6):RPMI－1640+0.2%BSA+0.04 mmol/L palmitate+20 μg/L IL－6，培養(yǎng)24 h后做相應(yīng)檢測。

2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測FAT/CD36的mRNA表達(dá) Trizol法提取細(xì)胞總RNA，在PrimeScript? RT Enzyme MixⅠ作用下逆轉(zhuǎn)成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件是:37℃ 15 min，85℃ 5 s。以2 μL cDNA作實(shí)時(shí)定量PCR檢測FAT/CD36 mRNA表達(dá)，同時(shí)以 β－actin作為內(nèi)參照，擴(kuò)增反應(yīng):50℃ 2 min，95℃ 5min預(yù)變性;95℃ 20 s，55℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為 25 μL。數(shù)據(jù)計(jì)算步驟是:ΔCt=CtFAT/CD36－Ctβ－actin;ΔΔCt= 處理組 ΔCt－對(duì)照組 ΔCt;處理組FAT/CD36 mRNA 表達(dá)為對(duì)照組的 2－ΔΔCt倍，即處理組FAT/CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量。設(shè)計(jì)的引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1.Human TaqMan primers for real－time PCR

2.4 Western blotting檢測FAT/CD36蛋白表達(dá) 提取的細(xì)胞總蛋白用BCA法蛋白定量并標(biāo)化統(tǒng)一濃度，上樣50～100 μg至6%SDS－PAGE凝膠電泳，再電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶37℃封閉1 h，兔抗FAT/CD36單克隆抗體(1∶200)和兔抗β－actin單克隆抗體(1∶3 000)，4℃孵育過夜。TBST清洗3次，10 min/次，Ⅱ抗均是1∶7 500稀釋比例37℃孵育1.5 h。TBST清洗3次，10 min/次，ECL光化學(xué)法顯色。

2.5 油紅O染色 將細(xì)胞種入6孔板，進(jìn)行細(xì)胞爬片油紅 O染色:PBS清洗3次，10%甲醛鹽固定30 min;PBS清洗2次，1，2－丙二醇孵育2 min后吸盡，油紅O染色30 min;雙蒸水清洗3次，蘇木素復(fù)染2 min;洗凈后甘油明膠封片。

2.6 酶比色法檢測細(xì)胞內(nèi)甘油三脂(triglyceride，TG)水平 收集細(xì)胞沉淀加入正庚烷、異丙醇混合抽提劑(2∶3.5)。超聲破碎細(xì)胞，離心后上清真空干燥后比色法進(jìn)行TG定量，而沉淀用1 mol/L NaOH溶解。24 h后進(jìn)行Lowry總蛋白定量，計(jì)算TG與細(xì)胞總蛋白含量的比值，即各組TG相對(duì)含量。

2.7 ELISA檢測細(xì)胞內(nèi)FFA水平 收集細(xì)胞沉淀加入氯仿、正庚烷、甲醇混合抽提劑(56∶42∶2)。超聲破碎細(xì)胞，離心后上清真空干燥，ELISA進(jìn)行FFA定量，而沉淀用1 mol/L NaOH溶解。24 h后進(jìn)行Lowry總蛋白定量，計(jì)算FFA與細(xì)胞總蛋白含量的比值，即各組FFA相對(duì)含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件，進(jìn)行方差分析比較不同處理組各項(xiàng)指標(biāo)的差異，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度脂肪酸對(duì)HMCs和HK－2細(xì)胞 FAT/CD36 mRNA表達(dá)的影響

當(dāng)負(fù)荷的軟脂酸濃度的增加，2種細(xì)胞FAT/CD36 mRNA表達(dá)也隨之增加，呈劑量依賴性。其中，HMCs在0.16 mmol/L軟脂酸濃度下、HK－2細(xì)胞在0.08 mmol/L軟脂酸濃度下FAT/CD36 mRNA表達(dá)相對(duì)于0 mmol/L濃度組有增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在0.32 mmol/L組2種細(xì)胞 FAT/CD36 mRNA表達(dá)相對(duì)于0 mmol/L濃度組增加更明顯(P ＜0.01)，見圖1。

Figure 1.Palmitate up－regulated the mRNA expression of FAT/CD36 in a concentration－dependent manner in HMCs and HK－2 cells.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L palmitate group.圖1 軟脂酸呈濃度依賴性上調(diào)HMCs和HK－2 FAT/CD36 mRNA表達(dá)

2 不同濃度脂肪酸對(duì)HMCs和HK－2細(xì)胞 FAT/CD36蛋白表達(dá)的影響

Western blotting顯示，不同濃度的軟脂酸處理HMCs和HK－2細(xì)胞24 h后，隨著軟脂酸的濃度增加，2種細(xì)胞FAT/CD36蛋白表達(dá)也增加，與細(xì)胞FAT/CD36 mRNA表達(dá)結(jié)果一致，見圖2。

Figure 2.Palmitate up－regulated the protein expression of FAT/CD36 in a concentration－dependent manner in HMCs and HK－2 cells.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 mmol/L palmitate group.圖2 軟脂酸呈濃度依賴性上調(diào)HMCs和HK－2 FAT/CD36蛋白表達(dá)

3 TNF－α和IL－6對(duì)脂肪酸負(fù)荷的HMCs和HK－2細(xì)胞FAT/CD36 mRNA表達(dá)的影響

25 μg/L TNF－α 和20 μg/L IL－6炎癥因子組與對(duì)照組相比，單純炎癥因子組FAT/CD36 mRNA表達(dá)均有增加，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。TNF－α組和IL－6組聯(lián)合0.04 mmol/L軟脂酸處理組與單純軟脂酸處理組相比，F(xiàn)AT/CD36 mRNA表達(dá)均明顯增加，差異顯著(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effects of palmitate(0.04 mmol/L)combined with TNF－α or IL－6 on the mRNA expression of FAT/CD36 in HMCs and HK－2 cells.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs palmitate group.圖3 軟脂酸聯(lián)合TNF－α和IL－6對(duì)HMCs和HK－2細(xì)胞FAT/CD36 mRNA表達(dá)的影響

4 TNF－α和IL－6對(duì)脂肪酸負(fù)荷的HMCs和HK－2細(xì)胞FAT/CD36蛋白表達(dá)的影響

Western blotting顯示，TNF－α 25 μg/L和IL－6 20 μg/L處理的負(fù)荷有0.04 mmol/L軟脂酸的HMCs和HK－2細(xì)胞FAT/CD36蛋白表達(dá)明顯增加，與mRNA表達(dá)結(jié)果一致，見圖4。

Figure 4.Effects of palmitate(0.04 mmol/L)combined with TNF－α or IL－6 on the protein expression of FAT/CD36 in HMCs and HK－2.±s.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs palmitate group.圖4 TNF－α和IL－6對(duì)軟脂酸負(fù)荷的HMCs和HK－2細(xì)胞FAT/CD36蛋白表達(dá)的影響

5 TNF－α和IL－6對(duì)脂肪酸負(fù)荷的HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響

油紅O染色顯示，在低濃度軟脂酸下，HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)出現(xiàn)輕微增加;TNF－α和IL－6處理后，紅染明顯增加，脂質(zhì)明顯增多;而聯(lián)合處理的腎細(xì)胞較單純軟脂酸處理的細(xì)胞，脂質(zhì)進(jìn)一步積聚。同時(shí)檢測HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)TG含量，結(jié)果與油紅O染色結(jié)果一致，見圖5、6。

通過酶免疫分析法檢測HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)FFA含量，并計(jì)算其相對(duì)量。0.04 mmol/L軟脂酸組與對(duì)照組相比，HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)FFA均增加不明顯;聯(lián)合處理組腎細(xì)胞相對(duì)于單純軟脂酸組來說，HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)FFA增加更明顯，差異顯著(P ＜0.05)，見圖7。

討 論

近來研究認(rèn)為，脂質(zhì)代謝紊亂是慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，當(dāng)機(jī)體處于代謝綜合征狀態(tài)下，可以引起腎臟內(nèi)脂質(zhì)沉積和腎損傷［5］。“脂質(zhì)腎毒性學(xué)說”認(rèn)為，體內(nèi)長期保持高游離脂肪酸水平，可以誘導(dǎo)腎細(xì)胞凋亡及促使糖尿病的發(fā)生，同時(shí)腎臟損害又可以導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂［6－8］。腎細(xì)胞脂肪酸的攝取代謝過程中有許多代謝酶參與，其中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶FAT/CD36是參與腎細(xì)胞脂肪酸代謝重要酶之一。FAT/CD36廣泛存在于骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞等各種組織細(xì)胞中，扮演著清道夫受體的角色，又參與長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化形成的過程。Chabowski等［9］研究 ZDF(Zucker diabetic fatty)大鼠在糖尿病前期胰島素抵抗階段，高脂喂養(yǎng)的青年大鼠出現(xiàn)骨骼肌FAT/CD36表達(dá)增加，同時(shí)使脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)增加66%，而且高脂飲食的小型豬同樣出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂，胸主動(dòng)脈、肝組織、腎組織FAT/CD36表達(dá)均增加。本研究也在體外實(shí)驗(yàn)中得出:脂肪酸負(fù)荷的腎細(xì)胞FAT/CD36表達(dá)增加，胞內(nèi)脂質(zhì)積聚增多。高濃度脂肪酸刺激細(xì)胞FAT/CD36 mRNA和蛋白的表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞FAT/CD36增加時(shí)，脂肪酸的攝取也會(huì)增多。Kuchibhotla等［10］研究認(rèn)為FAT/CD36可能不僅參與攝入修飾的脂蛋白所致動(dòng)脈粥樣硬化的過程，而且參與促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥過程。本實(shí)驗(yàn)中，在炎癥因子刺激下的腎細(xì)胞FAT/CD36表達(dá)也增加，說明炎癥反應(yīng)與組織細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá)可能存在一個(gè)潛在的互動(dòng)機(jī)制。

近來相關(guān)研究認(rèn)為，慢性腎臟疾病隨著腎功能進(jìn)行性損害常表現(xiàn)出以單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)激活，伴隨TNF－α、IL－6和C－反應(yīng)蛋白等促炎癥因子釋放的慢性炎癥過程［11］。炎癥可以刺激腎小球系膜細(xì)胞分泌多種炎癥細(xì)胞因子，如IL－6、IL－1，而這些細(xì)胞因子可通過旁分泌或自分泌的方式使炎癥效應(yīng)不斷放大，最終導(dǎo)致腎小球硬化和糖尿病腎病發(fā)生［12］。我們課題組通過大量體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)并提出:炎癥不僅可以改變脂質(zhì)代謝平衡，而且還是脂質(zhì)誘導(dǎo)腎臟損害的中間環(huán)節(jié)與關(guān)鍵因素［13－14］。

Figure 5.Lipid accumulation in HMCs and HK－2 cells examined by oil red O staining after palmitate treatment combined with TNF－α or IL－6(×400).A－F:HMCs;G－L:HK－2;A，G:control;B，H:TNF－α 25 μg/L;C，I:IL－6 20 μg/L;D，J:palmitate 0.04 mmol/L;E，K:palmitate 0.04 mmol/L plus TNF－α 25 μg/L;F，L:palmitate 0.04 mmol/L plus IL－6 20 μg/L.圖5 TNF－α和IL－6對(duì)軟脂酸負(fù)荷的HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響

Figure 6.TG level in HMCs and HK－2 cells after palmitate(0.04 mmol/L)treatment combined with TNF－α or IL－6.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05，##P ＜0.01 vs palmitate group.圖6 TNF－α和IL－6對(duì)軟脂酸負(fù)荷的HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚的影響

Figure 7.FFA level of HMCs and HK－2 cells after palmitate(0.04 mmol/L)treatment combined with TNF－α or IL－6.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs 0.04 mmol/L palmitate group.圖7 軟脂酸聯(lián)合TNF－α和IL－6對(duì)HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)FFA水平的影響

目前，炎癥對(duì)腎細(xì)胞脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響機(jī)制還不是十分清楚。本實(shí)驗(yàn)觀察到，不管是人系膜細(xì)胞(HMCs)還是人腎小管上皮細(xì)胞(HK－2)，在模擬正常人或代謝綜合征早期，處于低濃度脂肪酸水平的細(xì)胞FAT/CD36 mRNA和蛋白增加均不明顯。然而在低濃度脂肪酸負(fù)荷條件下，炎癥因子刺激的腎細(xì)胞FAT/CD36表達(dá)比單純低濃度脂肪酸組增加更明顯。而炎癥因子刺激增加的FAT/CD36也會(huì)使腎細(xì)胞攝取更多的脂肪酸。通過油紅O染色和腎細(xì)胞HMCs和HK－2細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸含量的測定進(jìn)一步證實(shí)這一結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明:炎癥因子可以進(jìn)一步上調(diào)脂肪酸負(fù)荷的腎細(xì)胞FAT/CD36的表達(dá)，以及加重胞內(nèi)脂質(zhì)積聚。該研究為闡明炎癥可能作為獨(dú)立致病因子在脂質(zhì)介導(dǎo)的腎損害中的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)，F(xiàn)AT/CD36途徑可作為一個(gè)切入點(diǎn)為新藥開發(fā)及臨床治療提供線索。

［1］ Ruan XZ，Varghese Z，Powis SH，et al.Dysregulation of LDL receptor under the influence of inflammatory cytokines:a new pathway for foam cell formation［J］.Kidney Int，2001，60(5):1716－1725.

［2］ Ruan XZ，Moorhead JF，Tao JL，et al.Mechanisms of dysregulation of low－density lipoprotein receptor expression in vascular smooth muscle cells by inflammatory cytokines［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26(5):1150－1155.

［3］ Ma KL，Ruan XZ，Powis SH，et al.Inflammatory stress exacerbates lipid accumulation in hepatic cells and fatty livers of apolipoprotein E knockout mice［J］.Hepatology，2008，48(3):770－781.

［4］ 李旭升，陳國榮，胡 野，等.糖尿病大鼠巨噬細(xì)胞CD36基因表達(dá)水平［J］.中國病理生理雜志，2007，23(11):2272－2273.

［5］ Spencer MW，Mühlfeld AS，Segerer S，et al.Hyperglycemia and hyperlipidemia act synergistically to induce renal disease in LDL receptor－deficient BALB mice［J］.Am J Nephrol，2004，24(1):20－31.

［6］ Lupi R，Dotta F，Marselli L，et al.Prolonged exposure to free fatty acids has cytostatic and pro－apoptotic effects on human pancreatic islets:evidence that β－cell death is caspase mediated，partially dependent on ceramide pathway，and Bcl－2 regulated［J］.Diabetes，2002，51(5):1437－1442.

［7］ Shimabukuro M，Zhou YT，Levi M，et al.Fatty acid－induced β cell apoptosis:a link between obesity and diabetes［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95(5):2498－2502.

［8］ Allick Q，Sprangers F，Weverling GJ.Free fatty acids increase hepatic glycogen content in obese males［J］.Metabolism，2004，53(7):886－893.

［9］ Chabowski A，Chatham JC，Tandon NN，et al.Fatty acid transport and FAT/CD36 are increased in red but not in white skeletal muscle of ZDF rats［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2006，291(3):675－682.

［10］ Kuchibhotla S，Vanegas D，Kennedy DJ，et al.Absence of CD36 protects against atherosclerosis in ApoE knockout mice with no additional protection provided by absence of scavenger receptor A Ⅰ/Ⅱ［J］.Cardiovasc Res，2008，78(1):185－196.

［11］ Panichi V，Migliori M，De Pietro S，et al.C－reactive protein as a marker of chronic inflammation in uremic patients［J］.Blood Purif，2000，18(3):183－190.

［12］ 田林紅，陳雪紅，倪安民，等.糖尿病腎病患者血清IL－1、IL－6含量測定［J］.中國病理生理雜志，2001，17(2):127，129.

［13］ Ruan XZ，Moorhead JF，Varghese Z.Lipid redistribution in renal dysfunction ［J］.Kidney Int，2008，74(4):407－409.

［14］ Ruan XZ，Varghese Z，Moorhead JF.An update on the lipid nephrotoxicity hypothesis［J］.Nat Rev Nephrol，2009，5(12):713－721.