唐 昱， 盛國太， 葛郁芝， 王云霞， 曹乾強(qiáng)， 周裔忠， 張繁之

(1江西省人民醫(yī)院心內(nèi)科，2江西省心血管病研究所，江西南昌330006)

肥厚心臟不僅表現(xiàn)在心臟結(jié)構(gòu)的改變，還可存在明顯的電生理特性改變，因此，探究心肌中其主導(dǎo)地位的鉀離子通道間的相互作用，在認(rèn)識(shí)心肌細(xì)胞電生理和進(jìn)行心律失常治療方面具有重大意義［1］。丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡA)是我國傳統(tǒng)中藥丹參的水溶性衍生物，具有抑制血小板黏附聚集、抗血栓形成、改善微循環(huán)、抗心肌缺血缺氧等功效，臨床上主要用于冠心病的治療，而有關(guān)抗心律失常作用的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，研究丹參酮ⅡA對(duì)肥厚心肌細(xì)胞快激活延遲整流鉀電流(the rapidly activating component of the delayed rectifier K+current，IKr)和慢激活延遲整流鉀電流(the slowly activating component of the delayed rectifier K+current，IKs)的影響，旨在從離子通道水平探討丹參酮ⅡA的抗心律失常作用機(jī)制，為肥厚心肌心律失常的防治提供新的理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物與試劑 60只健康雄性豚鼠，體質(zhì)量250～300 g(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(武漢生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)為080520)，纈沙坦(北京諾華制藥有限公司)。

1.2 儀器 彩色多普勒超聲診斷儀(惠普公司);倒置顯微鏡(北京科樂公司);膜片鉗儀微電極(上海奧爾科特生物科技有限公司);電極拉制儀(華科大儀博生命科學(xué)儀器有限公司);Axopatch 200B膜片鉗放大器(Axon);DigiData 1200B型數(shù)/模(或模/數(shù))轉(zhuǎn)換器(Axon)。

1.3 溶液配制 (1)臺(tái)式液(mmol/L):NaCl 136、KCl 5.4、MgCl21.0、NaH2PO40.33、CaCl21.8、HEPES 10、glucose 10，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.4。配制時(shí)不加CaCl2即為無鈣臺(tái)氏液。(2)KB液(mmol/L):KCl 40、KH2PO425、MgSO43.0、KOH 80、L－谷氨酸 50.3、牛磺酸 20、HEPES 10、glucose 10、EGTA 0.5，用KOH調(diào)節(jié)pH至7.4。記錄IKr時(shí)的細(xì)胞外液即為臺(tái)氏液。(3)記錄IKs時(shí)的細(xì)胞外液(mmol/L):NaCl 135、KCl 3.0、MgCl21.0、NaH2PO40.33、CaCl21.8、HEPES 10、glucose 10，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至7.4。(4)電極內(nèi)液(mmol/L):天門冬氨酸鉀120、KCl 20、HEPES 5、MgCl21.0、K2－ATP 4、EGTA 10、磷酸肌酸二鈉2.0，用KOH調(diào)pH到7.3。

2 方法

2.1 模型制作 分離腹主動(dòng)脈和腎動(dòng)脈后，在腎動(dòng)脈上方約1 cm處的腹主動(dòng)脈，用7號(hào)注射針頭緊貼腹主動(dòng)脈，平行放置，結(jié)扎，抽出注射針頭逐層縫合肌肉及皮膚。其中12只行假手術(shù)，分離腹主動(dòng)脈后不結(jié)扎。

2.2 血壓的測量 將實(shí)驗(yàn)豚鼠裝入固定盒內(nèi)固定，尾部通過加壓套插入至接近尾根部，使鼠尾剛好處于脈搏傳感器的“脈搏信號(hào)傳感片”上方，調(diào)節(jié)鼠尾壓迫片使傳感片緊貼鼠尾下方的尾動(dòng)脈，待脈搏穩(wěn)定后進(jìn)行血壓測量。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方式 12只行假手術(shù)的豚鼠為假手術(shù)組(A組)。48只成功建立心肌肥厚模型的豚鼠在術(shù)后4周隨機(jī)分為4組:未治療的肥厚模型組(B組)、低劑量丹參酮ⅡA組(10 mg·kg－1·d－1，C 組)、高劑量丹參酮ⅡA 組(20 mg·kg－1·d－1，D 組)和纈沙坦組(10 mg·kg－1·d－1，E 組)，每組各12只。給藥方式:采用腹腔注射，其中未治療的肥厚模型組和假手術(shù)組分別以等體積的蒸餾水腹腔注射。

2.4 心肌細(xì)胞分離 藥物干預(yù)8周后，開胸行在體主動(dòng)脈插管，在通氧(95%O2，5%CO2)和保持37℃恒溫的條件下進(jìn)行Langendorff灌流。用無鈣臺(tái)氏液［KCl 5.5、MgCl20.4、NaCl 140、NaH2PO40.33、HEPES 5、glucose 5.5(pH 7.4，NaOH)］逆行灌流3 ～5 min(壓力70 mmHg)，再用含0.4 g/L I型膠原酶、0.2 g/L蛋白酶 E、0.25 g/L小牛血清蛋白和80 μmol/L Ca2+的臺(tái)氏液循環(huán)灌流15 min后，然后用無鈣Tyrode液沖洗。剪去心房，用無酶的無鈣液終止酶解后取心室肌稱重，計(jì)算心室/體重比率(ventricle/weight ratio，VWR);再將心室肌在 KB液(KCl 40、KOH 70、KH2PO420、MgCl23、HEPES 10、EGTA 0.5、glucose 10、L－glumatic acid 50及 0.5%牛血清白蛋白)中室溫留置2 h備用。

2.5 膜片鉗全細(xì)胞記錄 選取紋理清晰、桿狀和大小適中的細(xì)胞在室溫下(22～25℃)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞膜片鉗進(jìn)行電生理數(shù)據(jù)收集。微電極經(jīng)垂直拉制儀拉制而成，充灌電極內(nèi)液后使電極阻抗保持在2～5 MΩ。采用微電極操縱器將電極緩慢推向細(xì)胞，同時(shí)給電極加約10 cmH2O正壓，當(dāng)電極貼緊細(xì)胞膜后給電極加10～20 cmH2O負(fù)壓，吸引數(shù)秒鐘使電極尖端與細(xì)胞膜表面形成1 GΩ以上高阻封接，信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，由膜片鉗放大器放大。在電流穩(wěn)定后開始記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。記錄的電流值以電流密度(pA/pF)表示以消除細(xì)胞間誤差。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 各實(shí)驗(yàn)組血壓測定

建立心肌肥厚模型組4周后測定血壓，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組血壓(123±8)mmHg相比較，各手術(shù)模型組的血壓波動(dòng)于(160±10)mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，各手術(shù)模型組間血壓無顯著差異(P ＞0.05)。

2 肥厚心肌病理生理改變

與A組相比，B、C、D和E組心室重量/體重比(ventricular weight/body weight，VW/BW)、左心室重量(left ventricular weight，LVM)和左室游離壁厚度(left ventricular free wall，LVFW)均升高(P ＜0.01);與B組相比，C、D和E組VW/BW、LVM和LVFW下降(P ＜0.01)，見表1。

3 各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞電生理變化

與A組相比，B組動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)明顯延長;而 C、D、E組的心肌細(xì)胞APD較肥厚組明顯縮短(P＜0.01);與A組相比，B組膜電容(membrane capacitance，MC)增加;而與B組相比，C組、D和E組的心肌細(xì)胞MC降低(P＜0.01)，見表 2。

表1 各實(shí)驗(yàn)組左心室重量、左室游離壁厚度和心室重量/體重的比較Table 1.The LVM，LVFW and VW/BW in each experimental group(±s.n=12)

表1 各實(shí)驗(yàn)組左心室重量、左室游離壁厚度和心室重量/體重的比較Table 1.The LVM，LVFW and VW/BW in each experimental group(±s.n=12)

＊＊P＜0.01 vs group A;##P ＜0.01 vs group B.A:control;B:model;C:tanshinone ⅡA 10 mg·kg－1·d－1;D:tanshinoneⅡA 20 mg·kg－1·d－1;E:valsartan 10 mg·kg－1·d－1.

Group LVM(g) LVFW(mm)VM/BW(mg/g)A 3.9 ±0.1 4.8 ±0.1 3.0 ±0.3 B 8.1 ±0.2＊＊ 7.1 ±0.3＊＊ 4.8 ±0.2＊＊C 6.4 ±0.1## 5.6 ±0.6## 3.6 ±0.4##D 6.1 ±0.3## 5.5 ±0.4## 3.5 ±0.3##E 6.5 ±0.2## 5.8 ±0.4## 3.4 ±0.6##

表2 各實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)作電位時(shí)間和膜電容變化Table 2.The action potential duration and membrane capacitance in each experimental group(±s.n=12)

表2 各實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)作電位時(shí)間和膜電容變化Table 2.The action potential duration and membrane capacitance in each experimental group(±s.n=12)

##P ＜0.01 vs group A;△△P ＜0.01 vs group B.

Group APD25(ms) APD50(ms) APD75(ms) APD90(ms) MC(pF)A 6.2 ±0.1 15.8 ±2.4 20.4 ±4.6 38.6 ±2.9 246 ±17 B 16.9 ±1.8## 75.7 ±3.0## 90.3 ±10.5## 123.7 ±12.8## 391 ±14##C 9.2 ±0.4△△ 20.8 ±3.6△△ 43.2 ±3.7△△ 50.8 ±7.9△△ 279 ±10△△D 7.1 ±0.3△△ 17.6 ±2.5△△ 31.3 ±4.0△△ 40.6 ±4.2△△ 258 ±11△△E 9.4 ±0.3△△ 20.2 ±1.9△△ 40.1 ±5.8△△ 51.2 ±6.4△△ 280 ±16△△

4 IKr及其尾電流 IKr－tail的測定

為排除干擾電流的影響，細(xì)胞外液中加入5 μmol/L硝苯地平 (ICa－L，特異性阻斷劑)和 30 μmol/L二乙酰醇293B(IKs特異性阻斷劑)以阻斷Ica－L和 IKs。鉗制電位(holding potential，HP)為－50 mV，去極化至－10 mV，5 000 ms的去極化脈沖，分別記錄各實(shí)驗(yàn)組的IKr及IKr－tail電流(n=5)。與A組相比較，B 組 IKr及 IKr－tail電流均增強(qiáng)，而 C、D 和 E 組IKr及 IKr－tail電流比 B 組顯著降低(P ＜0.05)，C、D、E組間無顯著差異(P＞0.05)，見圖1、表3。

5 IKs及其尾電流 IKs－tail的測定

細(xì)胞外液中加入 5 μmol/L 硝苯地平(ICa－L，特異性阻斷劑)和100 μmol/L多菲利特(IKr特異性阻斷劑)以阻斷ICa－L和IKr。從－40 mV去極化至 +80 mV，5 000 ms的去極化脈沖，分別記錄各實(shí)驗(yàn)組的IKs及 IKs－tail電流(n=5)。與 A 組相比較，B 組 IKs及IKs－tail電流均增強(qiáng)，C、D 和 E 組心肌細(xì)胞 IKs及 IKs－tail比B組顯著降低(P＜0.05)，見圖2、表3。

討 論

Figure 1.The IKrchanges of cardiomyocytes in each experimental group.圖1 各實(shí)驗(yàn)組IKr的變化

心肌肥厚是心肌細(xì)胞對(duì)各種內(nèi)在和外在刺激引起的負(fù)荷過重的一種適應(yīng)和代償性反應(yīng)。當(dāng)負(fù)荷超過一定界限時(shí)，心臟結(jié)構(gòu)、功能和離子通道均可發(fā)生變化，不僅心肌細(xì)胞肥大和間質(zhì)成分發(fā)生改變，還可導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜上多種跨離子電流的異常改變，其APD延長，誘發(fā)嚴(yán)重的心律失常和心源性猝死［2－3］。本研究通過結(jié)扎腹主動(dòng)脈制作心肌肥厚模型，證實(shí)肥厚心肌LVM、LVFW和VM/BW升高，APD明顯延長，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4］。

Figure 2.The IKschanges of cardiomyocytes in each experimental group.圖2 各實(shí)驗(yàn)組IKs的變化

表3 各實(shí)驗(yàn)組IKr、IKs及其尾電流的變化Table 3.The changes of IKr，IKs，IKr－tailand IKs－tail in each experimental group(pA/pF.±s.n=12)

表3 各實(shí)驗(yàn)組IKr、IKs及其尾電流的變化Table 3.The changes of IKr，IKs，IKr－tailand IKs－tail in each experimental group(pA/pF.±s.n=12)

*P ＜0.05 vs group A;△P ＜0.05 vs group B.

Group IKr IKr－tail IKs I Ks－tail A 1.28 ±0.09 1.49 ±0.20 5.98 ±1.09 0.69 ±0.14 B 1.89 ±0.10* 2.14 ±0.16* 11.59 ±1.11* 1.13 ±0.13*C 1.45 ±0.12△ 1.71 ±0.19△ 7.85 ±1.05△ 0.88 ±0.13△D 1.39 ±0.11△ 1.67 ±0.14△ 7.76 ±1.04△ 0.81 ±0.12△E 1.46 ±0.13△ 1.73 ±0.20△ 7.87 ±1.08△ 0.90 ±0.16△

心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的形成是細(xì)胞膜上多種離子通道順序開關(guān)綜合作用的結(jié)果，任何離子通道電流的異常均可影響正常動(dòng)作電位的形成，導(dǎo)致各種心律失常的發(fā)生［5］。IKr是鉀通道基因編碼的延遲整流鉀電流的快成分，開放時(shí)間非常短，而關(guān)閉的時(shí)間則相對(duì)較長，對(duì)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位2相平臺(tái)期的終止及3相復(fù)極化具有重要的意義［6］。IKs是動(dòng)作電位復(fù)極的重要組成部分，其基因表達(dá)異?？墒沟猛庀驈?fù)極電流減少，細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程延長［7］。IKr和IKs對(duì)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位平臺(tái)期和復(fù)極化具有重要意義［8－9］。研究表明，病變心肌 IKr和 IKs明顯增強(qiáng)，可由折返機(jī)制形成快速性心律失常，易發(fā)生心室纖顫，增加心源性猝死的危險(xiǎn)性。本實(shí)驗(yàn)觀察到與假手術(shù)組相比較，肥厚心肌IKs和IKs及其尾電流均增大，具有致心律失常性離子通道病變的基礎(chǔ)［10］。

心肌鉀離子通道在電生理學(xué)研究方面取得了許多新進(jìn)展，人們開始懷疑鉀離子通道能否成為抗心律失常藥物有益的作用靶點(diǎn)。于鋒等［11］采用L－甲狀腺素誘發(fā)豚鼠心肌病模型，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿明顯阻斷肥厚心肌細(xì)胞中異常增大的IKr和IKs，為藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供了有利的依據(jù)。中醫(yī)藥學(xué)具有我國的傳統(tǒng)和特色，人們在長期的臨床實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)許多中藥具有抗心律失常及潛在的預(yù)防猝死作用。丹參酮IIA是中藥丹參的提取物，具有異搏停L型鈣通道阻斷作用，清除自由基，抗動(dòng)脈粥樣硬化，降低心肌耗氧量，抑菌和抗腫瘤等作用［12］。王照華等［13］報(bào)道丹參酮能夠在抗心肌肥厚的同時(shí)通過減少ICa和恢復(fù)Ito鉀離子通道的活性，起到預(yù)防心律失常的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA和纈沙坦都能顯著縮短肥大心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)間的延長，抑制肥厚心肌細(xì)胞上增大的IKr和IKs電流密度。但不同劑量丹參酮之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本實(shí)驗(yàn)觀測的時(shí)點(diǎn)有關(guān)，具體還需要深入研究加以證實(shí)。心肌動(dòng)作電位形成是多種離子通道共同參與的過程，決定復(fù)極過程的時(shí)程通道電流，主要有Ito、ICa、IKr和 IKs等。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示丹參酮對(duì)動(dòng)作電位時(shí)程的影響，可能比較復(fù)雜，可能通過多通道阻斷整合發(fā)揮作用。研究表明血管緊張素Ⅱ1型受體拮抗劑如纈沙坦等藥物可通過降低上游損失從而減輕與心肌重構(gòu)和跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路系統(tǒng)異常等相關(guān)的離子通道病［14］。但是丹參酮ⅡA是否通過類似的機(jī)制的對(duì)肥厚心肌動(dòng)作時(shí)程的整合作用，有待進(jìn)一步研究。

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