譚 真，李 潔，黎明濤，劉 煒，于文娟#，夏婷婷

(中山大學(xué)1附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，2中山醫(yī)學(xué)院研究中心蛋白質(zhì)組學(xué)，廣東廣州510080)

“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能的及時(shí)轉(zhuǎn)換是胚胎著床與母胎界面形成的關(guān)鍵。長(zhǎng)期以來(lái)，臨床工作中主要通過(guò)超聲測(cè)定內(nèi)膜厚度與形態(tài)以及血清激素水平評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜的功能狀態(tài)。然而血清雌、孕激素水平與子宮內(nèi)膜發(fā)育并不完全同步，內(nèi)膜的厚度與形態(tài)也不能準(zhǔn)確說(shuō)明其形態(tài)學(xué)改變。既往研究報(bào)道的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞吞飲泡、整合素αVβ3、白血病抑制因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)可以部分地反映子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎的接受性[1－2]。但至今為止，還未能找到更完整的、能動(dòng)態(tài)反映子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性變化的方法。

近年來(lái)基因芯片技術(shù)在人類(lèi)子宮內(nèi)膜研究的結(jié)果表明:“種植窗”時(shí)期存在多個(gè)基因表達(dá)的上調(diào)和下調(diào)[3－5]。然而關(guān)于功能基因蛋白質(zhì)組群的表達(dá)和研究還未見(jiàn)報(bào)道。我們選擇正常生育能力婦女，采用熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D －DIGE)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix－assisted laser desorption/ionization time－of－flight mass spectrometry，MALDI－TOF－MS)為主的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、Western blotting技術(shù)鑒定和分析子宮內(nèi)膜組織蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，并查找文獻(xiàn)進(jìn)行差異表達(dá)蛋白質(zhì)功能的聚類(lèi)分析，從整體水平、連續(xù)、動(dòng)態(tài)地探討子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性轉(zhuǎn)化過(guò)程中的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料來(lái)源

2005年9月～2006年2月募集有正常生育能力的女性志愿者4名并簽署知情同意書(shū)，年齡分別為30、30、32、33歲。采用經(jīng)陰道超聲檢測(cè)卵泡發(fā)育結(jié)合血、尿黃體生成素(luteinizing hormone，LH)激素測(cè)定。以血清LH＞20 IU/L或基礎(chǔ)值4倍確定為L(zhǎng)H峰值日。分別于同一婦女同一月經(jīng)周期“種植窗”前期(LH+2 d)和“種植窗”時(shí)期(LH+7 d)，采用Wallace endometrial sampler先后進(jìn)行2次微創(chuàng)組織活檢，獲取子宮腔前、后壁內(nèi)膜組織約0.2～0.4 g作為自身對(duì)照實(shí)驗(yàn)材料。一部分組織行HE染色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)和雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)測(cè)定評(píng)估，根據(jù)Noveys標(biāo)準(zhǔn)確定組織學(xué)分期。另一部分組織經(jīng)裂解、勻漿、離心、純化、濃度測(cè)定后用于蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)和Western blotting半定量分析。

2 方法

2.1 2D－DIGE 熒光染料CyDyes標(biāo)記樣品蛋白(熒光標(biāo)記試劑盒，Amersham Biosciences)，進(jìn)行一向等電聚焦電泳和二向十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳。激光掃描儀掃描成像，DeCyder軟件進(jìn)行圖像分析，定量蛋白豐度差異，確定差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。根據(jù)以下3個(gè)標(biāo)準(zhǔn):(1)比較LH+2 d和LH+7 d蛋白斑點(diǎn)的差異，進(jìn)行t－test，P＜0.05;(2)灰度差異＞1.40倍;(3)同一蛋白在12個(gè)蛋白表達(dá)譜中出現(xiàn)≥10次，選取斑點(diǎn)作為入選的差異斑點(diǎn)。進(jìn)一步刪除三維圖中無(wú)凸起、脫尾、與局部未入選斑點(diǎn)比較變化趨勢(shì)相同的斑點(diǎn)后確認(rèn)將進(jìn)入質(zhì)譜分析的差異表達(dá)斑點(diǎn)，并在2張制備膠選中和標(biāo)記相應(yīng)斑點(diǎn)，建立切點(diǎn)目錄。

2.2 質(zhì)譜分析 將切點(diǎn)目錄輸入全自動(dòng)斑點(diǎn)處理工作站，進(jìn)行斑點(diǎn)切割、沖洗、干燥、酶解消化、加入基質(zhì)和質(zhì)譜靶點(diǎn)樣等操作后，使用MALDI－TOFMS測(cè)定其在膠內(nèi)酶降解后的肽質(zhì)量指紋圖譜，并到本地和在線(xiàn)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證。

2.3 差異蛋白資料分析 登陸ExPASy網(wǎng)站尋找相關(guān)蛋白質(zhì)的資料，在PubMed查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行蛋白質(zhì)功能聚類(lèi)分析并探討其與胚胎著床關(guān)系。

2.4 Western blotting驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果 選擇annexin IV作為目的蛋白，參照Western blotting(Cell Signaling)說(shuō)明書(shū)操作。Western blotting顯影結(jié)果掃描定量分析目的條帶積分吸光度值(A值)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 子宮內(nèi)膜組織時(shí)相和功能的確定

結(jié)果顯示，LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜分別呈現(xiàn)分泌早期和中期組織學(xué)改變，ER和PR表達(dá)符合正常黃體期子宮內(nèi)膜組織的變化趨勢(shì)，提示子宮內(nèi)膜時(shí)相正常，見(jiàn)表1。

表1 LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜形態(tài)和ER、PR檢測(cè)Table 1.The histological changes and expression of ER and PR in LH+2 d and LH+7 d(%.±s.n=4)

表1 LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜形態(tài)和ER、PR檢測(cè)Table 1.The histological changes and expression of ER and PR in LH+2 d and LH+7 d(%.±s.n=4)

Phase Histological change ER PR Epithelia Stroma cells Epithelia Stroma cells LH+2 d Early secretory phase 92.5 ±2.9 52.5 ±26.3 88.8 ±6.3 70.0 ±21.6 LH+7 d Mid －secretory phase 50.0 ±21.6 37.5 ±18.9 37.5 ±32.0 62.5 ±15.0

2 2D－DIGE圖譜

每張2D－DIGE凝膠經(jīng)3種不同波長(zhǎng)的激光掃描可得到3個(gè)分別由Cy2、Cy3和Cy5標(biāo)記的不同蛋白質(zhì)樣品圖像及合并的膠內(nèi)差異圖像，見(jiàn)圖1，Decyder軟件分析檢測(cè)到(2 555±98)個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。

Figure 1.2D －DIGE images of endometrial proteins during the implantation window.Individual proteins of endometrial LH+2 d，LH+7 d samples and a pooled internal standard were labeled with CyDyes Cy3，Cy5 and Cy2，and were mixed and separated on a 2D gel using 24 cm pH 3～10 NL strips in the first dimension and 10%SDS－PAGE gels in the second dimension.Gels were scanned to obtain single images of the internal standard(Cy2，red)(A)，LH+2 d proteins(Cy3，green)(B)and LH+7 d proteins(Cy5，blue)(C).An overlay of the three dyes(Cy2，Cy3，Cy5)(D)is shown.圖1 “種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)的2D－DIGE凝膠圖像

3 MALDI－TOF－MS鑒定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中判斷差異表達(dá)斑點(diǎn)的3個(gè)篩選標(biāo)準(zhǔn)獲得入選斑點(diǎn)167個(gè)，確認(rèn)差異表達(dá)斑點(diǎn)81個(gè)進(jìn)入MALDI－TOF－MS PMF法鑒定，并通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)和Swissprot在線(xiàn)檢索鑒定，查找和確認(rèn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)共31個(gè)，其中17個(gè)上調(diào)表達(dá)，14個(gè)下調(diào)表達(dá)。

圖2～5顯示在2D－DIGE圖譜編號(hào)為2 033、pI約5.8、分子量約36的差異蛋白斑點(diǎn)的2D－DIGE斑點(diǎn)圖、三維圖、MS鑒定圖和Swissport在線(xiàn)檢索結(jié)果。該斑點(diǎn)經(jīng)鑒定為annexin IV，LH+7 d蛋白質(zhì)表達(dá)量為L(zhǎng)H+2 d的2.12倍。

Figure 2.Three－dimensional view and spot map of annexin IV.圖2 AnnexinⅣ在LH+2 d和LH+7 d的差異表達(dá)圖

Figure 3.Graph view of annexin IV.圖3 AnnexinⅣ在LH+2 d/+7 d的差異表達(dá)圖

Figure 4.Mass spectral identification of annexin IV.圖4 AnnexinⅣ的質(zhì)譜鑒定

Figure 5.The searching result of peptide mapping fingerprint by Swissprot database was annexinⅣ.圖5 肽指紋圖譜經(jīng)Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果為AnnexinⅣ

4 差異蛋白資料分析

登陸ExPASy網(wǎng)站尋找相關(guān)蛋白質(zhì)的資料，在PubMed查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)上述31個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)功能涉及到細(xì)胞遷移與融合、酶活性改變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控、血管生成和凝血纖溶等6大功能組，見(jiàn)表2。

5 Western blotting測(cè)定annexin IV差異表達(dá)

圖6結(jié)果表明annexin IV在LH+2 d和LH+7 d A值分別為46.249±32.376和249.507±31.959，P＜0.01，提示LH+7 d子宮內(nèi)膜組織annexin IV表達(dá)量較LH+2 d顯著增加。Western blotting結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析annexin IV表達(dá)趨勢(shì)一致，證實(shí)蛋白質(zhì)組學(xué)方法的準(zhǔn)確性。

表2 31個(gè)“種植窗”時(shí)期人類(lèi)子宮內(nèi)膜組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)Table 2.31 differentially expressed proteins identified in endowing the endometrium with receptivity

討 論

人類(lèi)胚胎種植的低效率至今依然是生殖生物學(xué)領(lǐng)域中最大的挑戰(zhàn)。文獻(xiàn)報(bào)道這種低種植率現(xiàn)象與子宮內(nèi)膜－胚胎發(fā)育不同步，臨床缺乏預(yù)測(cè)與評(píng)估胚胎發(fā)育潛能和子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性的客觀(guān)方法密切相關(guān)。由于人類(lèi)子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性存在時(shí)、空的短暫性，即胚胎著床活動(dòng)受到“種植窗”時(shí)期的限制，“種植窗”的啟動(dòng)常常發(fā)生在內(nèi)源性L(fǎng)H峰第4 ～5d，關(guān)閉發(fā)生在第9 ～10d[5]。因此探討在“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜組織的分子生物學(xué)變化及其機(jī)制是一個(gè)亟待解決的重要課題。

Figure 6.Annexin IV and β －actin levels were determined by Western blotting in LH+2 d(group A，A1－A4)and LH+7 d(group B，B1－B4)tissues.圖6 Western blotting檢測(cè)LH+2 d和LH+7 d annexin IV表達(dá)和目的條帶積分吸光度值

子宮內(nèi)膜是一種形態(tài)、功能都高度依賴(lài)激素調(diào)節(jié)的組織，增殖期子宮內(nèi)膜向接受態(tài)的轉(zhuǎn)化嚴(yán)格受到雌、孕激素和目前還未知因素的調(diào)控。排卵后子宮內(nèi)膜及時(shí)向接受態(tài)轉(zhuǎn)化，出現(xiàn)組織重建、細(xì)胞按一定的時(shí)、空順序分泌相關(guān)蛋白或/和局部因子，以期識(shí)別胚胎形成具有接受胚胎著床能力的子宮內(nèi)膜。既往的研究由于被研究因子的獨(dú)立與局限、研究方法缺乏時(shí)、空連續(xù)性以及多因子表達(dá)的同期比較，其結(jié)果不足以真實(shí)地反映代表圍“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜形態(tài)與功能轉(zhuǎn)化過(guò)程中局部因子的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系和調(diào)節(jié)機(jī)制。近年來(lái)基因芯片技術(shù)在該領(lǐng)域的應(yīng)用結(jié)果已經(jīng)證實(shí)“種植窗”時(shí)期出現(xiàn)了數(shù)十個(gè)與胚胎著床相關(guān)基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，并對(duì)小部分特異基因進(jìn)行了篩選、分析和克隆研究[3－5]。但是基因表達(dá)的結(jié)果并不能完全預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾與功能變化。而子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性的功能改變是一個(gè)多基因、多步驟和多階段的過(guò)程，由不同功能的蛋白質(zhì)在時(shí)間與空間上有序協(xié)同作用的結(jié)果。因此我們選用了能夠描述基因調(diào)節(jié)，對(duì)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定的、反映蛋白質(zhì)組分整體變化的蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行研究。

對(duì)復(fù)雜組織表達(dá)的多種蛋白質(zhì)進(jìn)行研究面臨的主要問(wèn)題是生物學(xué)變異，包括個(gè)體差異和組織時(shí)相的差異。我們選擇正常生育能力的婦女，于同一月經(jīng)周期LH+2 d和LH+7 d子宮內(nèi)膜取材，挑選組織時(shí)相符合分泌早期和分泌中期配對(duì)的子宮內(nèi)膜，從而減少了由于個(gè)體和組織時(shí)相差異導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果。“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜處于高度血管化狀態(tài)，單純使用PBS沖洗不能有效去除血清蛋白，可能導(dǎo)致膠內(nèi)特定區(qū)域分辨率下降，掩蓋非血清蛋白。本研究選擇Berendt等[6]報(bào)道的飽和蔗糖緩沖液(含104IU/L肝素)方法沖洗子宮內(nèi)膜組織10 min，大幅降低血清蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛋白質(zhì)圖譜未見(jiàn)明顯的血清蛋白點(diǎn)，進(jìn)一步證實(shí)該方法的可行性。

本研究采用2D－DIGE是雙向電泳的重要?jiǎng)?chuàng)新，該方法使用熒光標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記蛋白樣品，采用多重分析方式，利用所有樣本中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)同內(nèi)標(biāo)比較分析其差異值，能夠消除凝膠之間的偏差，減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證所檢測(cè)到蛋白豐度變化的精確度，且熒光檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)范圍廣，與傳統(tǒng)的雙向電泳相比有重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高、標(biāo)準(zhǔn)化和高效的優(yōu)點(diǎn)[7]。從2D－DIGE圖譜中可見(jiàn)(2 555±98)個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，該結(jié)果靈敏度與Marouga等[8]報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。參考本校蛋白質(zhì)組學(xué)系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)，采用2DDIGE方法可檢測(cè)到差異大于10%的蛋白質(zhì)，為提高分辨率我們以差異＞1.4倍作為標(biāo)準(zhǔn)，選擇在12個(gè)蛋白表達(dá)譜中表達(dá)≥10次(P＜0.05)的斑點(diǎn)167個(gè)，確認(rèn)差異表達(dá)斑點(diǎn)81個(gè)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。并通過(guò)NCBI和Swissprot在線(xiàn)檢索，查找和確認(rèn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)共31個(gè)。Berendt等[6]報(bào)道pH 4～7和pH 7～9 IPG膠條進(jìn)行同一小牛子宮內(nèi)膜樣本IEF，分別獲得1180和350個(gè)蛋白斑點(diǎn)，提示本研究使用寬范圍的IPG膠條(pH 3～10)進(jìn)行IEF。觀(guān)察2D－DIGE圖譜可見(jiàn)堿性端蛋白斑點(diǎn)密集，提示擴(kuò)大等電點(diǎn)范圍電泳將有利于獲得更多的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，針對(duì)該問(wèn)題，今后研究可采用分離堿性蛋白質(zhì)的IPG膠條(pH 6～11，8～11，9～12)以擴(kuò)大獲得的差異蛋白質(zhì)數(shù)量。

本研究獲得“種植窗”時(shí)期正常生育能力婦女子宮內(nèi)膜組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)31個(gè)，包括膜蛋白、蛋白酶和肽、鈣離子結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子、細(xì)胞黏附分子等，其中17個(gè)表達(dá)上調(diào)，14個(gè)表達(dá)下調(diào)。首次報(bào)道21個(gè)“種植窗”時(shí)期子宮內(nèi)膜組織差異表達(dá)蛋白質(zhì)，其中10個(gè)表達(dá)上調(diào)，11個(gè)表達(dá)下調(diào)。其中21個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)與人類(lèi)子宮內(nèi)膜對(duì)胚胎接受性的關(guān)系還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。通過(guò)文獻(xiàn)查找發(fā)現(xiàn)31個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)功能涉及到細(xì)胞遷移與融合、酶活性改變、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控、血管生成和凝血纖溶等6大功能組，這些蛋白質(zhì)功能與胚胎種植過(guò)程中所涉及的多種生物學(xué)活動(dòng)相一致。值得注意的是與以往基因水平研究發(fā)現(xiàn)的基因表達(dá)存在較大差異[4－5]。這種現(xiàn)象是否與本研究使用的IPG膠條(pH 3～10)測(cè)定到的蛋白質(zhì)有限或與從基因到蛋白質(zhì)水平表達(dá)存在時(shí)空差異有關(guān)還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Annexin IV屬于annexin家族，是Ca2+依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，具有促進(jìn)膜融合，參與囊胞運(yùn)輸、鈣離子通道形成、細(xì)胞骨架活動(dòng)、磷脂化與膜受體的功能調(diào)節(jié)以及胞吞、胞吐和分泌等重要生物功能[9]。近年對(duì)annexin IV在腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散過(guò)程中的研究提示其可能參與生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)換過(guò)程[10]。而胚胎種植過(guò)程中子宮內(nèi)膜從非接受態(tài)向接受態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及上述類(lèi)似的生物學(xué)過(guò)程。Riesewijk等[4]采用基因芯片技術(shù)比較LH+2 d/+7 d人類(lèi)子宮內(nèi)膜annexin IV基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)在“種植窗”期上調(diào)4倍。本研究蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示annexin IV表達(dá)增強(qiáng)2.12倍;Western blotting結(jié)果顯annexin IV表達(dá)趨勢(shì)與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致，提示子宮內(nèi)膜向接受態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中存在annexin IV表達(dá)量的顯著增加。此結(jié)果與Ponnampalam等[11]報(bào)道結(jié)果一致。同時(shí)驗(yàn)證了我們建立的微創(chuàng)子宮內(nèi)膜組織活檢取材方法聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)研究體系的準(zhǔn)確性和可靠性。

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