宋歡歡， 徐尚華△， 黃茂芝， 許昌聲， 謝良地

(1福建醫(yī)科大學附屬南平第一醫(yī)院心內科，福建南平353000;2福建省高血壓研究所，福建福州350004)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種炎癥性、免疫性疾病。單核細胞趨化蛋白 1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP－1)可募集血液中的單核細胞遷移至內膜下，同時促進血管內膜炎性反應，參與動脈粥樣硬化起始過程。研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性心絞痛、血管痙攣、急性冠脈綜合癥病人血漿MCP－1表達增高;阻斷MCP－1可以阻止血管早期炎癥反應[1－2]。在動脈粥樣硬化、糖尿病等心血管和代謝性疾病中，氧化應激致細胞內ROS表達增高，參與血管炎癥過程[3－4]。研究發(fā)現(xiàn)，MCP－1的釋放加速動脈粥樣硬化過程中活性氧的產生[5]。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)是AS的一個新的獨立危險因素。研究表明，AS患者血清Hcy水平明顯高于正常人，且與病情的嚴重程度呈正相關[6－7]。過氧化物酶體增殖物激活受體 δ(peroxisome proliferator activated receptor δ，PPARδ)是一類依賴配體激活的核激素受體，屬于類固醇受體超家族。PPARδ不但是脂肪酸代謝的一個重要調節(jié)者，而且研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥、動脈粥樣硬化中也發(fā)揮重要作用[8－10]。本研究通過觀察 PPARδ 激活后對Hcy誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)表達MCP－1的影響并探討其機制。為動脈粥樣硬化，尤其是伴有高同型半胱氨酸血癥的動脈粥樣硬化等心血管和代謝紊亂疾病提供潛在的治療靶點。

材料和方法

1 主要試劑及儀器

M199細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、0.1%Ⅰ型膠原酶、0.25%胰酶－EDTA(Gibco);二氧化碳培養(yǎng)箱(Napco);倒置相差熒光顯微鏡(Olympus);Hcy、GW0742、DPI干粉(Sigma);RT－PCR試劑盒、Tag酶(Fermentas);Trizol試劑、瓊脂糖(Invitrogen);PPARδ抗體(Abcam);β－actin抗體(Santa Cruz);辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(中杉金橋公司);vWF抗體(Dako);山羊抗兔IgG－R(Santa Cruz);活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司);硝酸纖維素膜(Millipore);紫外分光光度計(上海儀器廠);PCR擴增儀(Bioneer);高速低溫離心機(Beckman);系列凝膠成像系統(tǒng)(Vilber Lourmat);水平瓊脂糖電泳槽、DYCZ－24DN型 雙垂直電泳儀、DYCP－40C型半干式碳板轉印儀和DYY－III－6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。

2 方法

2.1 細胞消化及培養(yǎng) 在無菌條件下，取健康產婦剖宮產后新鮮的胎兒臍帶15～20 cm(標本來自福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院)，低溫保存于M199培養(yǎng)基中，4 h內進行細胞消化分離。采用膠原酶消化法分離HUVECs，于超凈臺內在臍靜脈一端插入16號針頭并以止血鉗固定，用37℃預熱的PBS沖洗至無血跡，用另一把止血鉗夾住臍帶的另一端，注入預熱的0.1%Ⅰ型膠原酶10～15 mL至臍靜脈充盈飽滿，室溫消化15 min;用不含F(xiàn)BS的M199培養(yǎng)液沖洗1遍，將消化液收集入15 mL無菌離心管，1 500 r/min離心10 min;棄上清，用含20%FBS的M199完全培養(yǎng)液吹打成細胞懸液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。根據細胞生長情況每2～3 d換液，用第2代或第3代細胞進行實驗。

2.2 細胞鑒定 取1代細胞進行細胞爬片，待細胞鋪滿80%左右，PBS洗滌3次;用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次;在含0.5%Triton X －100的PBS中孵育20 min，PBS洗滌3次;1%BSA室溫封閉30 min，Ⅰ抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次;Ⅱ抗37℃孵育1 h，PBS洗滌3次;熒光顯微鏡下觀察。

2.3 實驗分組 取2～3代細胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細胞鋪滿80%左右，換用優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化，實驗分為對照組、Hcy組、GW0742(PPARδ特異激動劑)組和二亞苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI，NAPDH 氧化酶特異抑制劑)組;先加入 GW0742(終濃度 10－6mol/L)、DPI(終濃度10－5mol/L)，30 min 后加入 Hcy(終濃度 10－3mol/L)作用24 h后處理細胞(每次實驗每組設2個復孔，實驗重復5次)。

2.4 RT－PCR檢測目的基因 采用Trizol試劑一步法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測濃度后，按RT－PCR說明書操作逆轉錄為cDNA，后加PCR Mix及相應引物擴增MCP－1、PPARδ及GAPDH。MCP－1上游引物5'－ATGAAAGTCTCTGCCGCC －3'，下游引物 5'－TTGCTTGTCCAGGTGGTC －3'，290 bp;PPARδ 上游引物 5'－ACGCTATCCGTTTGGTCG －3'，下游引物 5'－CTCACGGGTGACAAAGCC －3'，524 bp;內參照(GAPDH)上游引物5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC － 3'，下游引物 5'－ TCCACCACCTGTTGCCTGTA －3'，454 bp。反應條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)，72 ℃10 min;PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析其吸光度值，目的基因和內參照的吸光度比值作為mRNA的相對表達量。

2.5 Western blotting檢測 PPARδ蛋白表達 以預冷PBS洗滌干預細胞2次，添加了PMSF和蛋白酶抑制劑的細胞裂解緩沖液于冰上裂解細胞5 min，用細胞刮刮下細胞并收集至1.5 mL的離心管中，超聲振蕩，按上樣緩沖液和蛋白4∶1混合，100℃水浴5 min;12 000 r/min離心5 min，取上清－80℃冰箱保存。經電泳、轉膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;加入Ⅰ抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min;再加HRP標記的Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;發(fā)光劑ECL盒顯色反應。用凝膠圖像分析所得電泳圖的平均吸光度值。

2.6 細胞內ROS初級熒光測定 用24孔培養(yǎng)板干預細胞，按 ROS檢測試劑盒說明，取 130 μL Genmed染色液(Reagent B)至15 mL離心管，加入12.870 mL Genmed稀釋液(Reagent C)，混勻后，標記為Genmed染色工作液，避光37℃保存;然后抽去24孔板中的細胞培養(yǎng)液，沿著孔壁各孔加入500 μL Genmed染色工作液，37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育20 min;抽出Genmed染色工作液，沿著孔壁各加入500 μL 37℃預熱的 Genmed 保存液(Reagent D)，倒置熒光顯微鏡觀察，拍照。用Image－Pro Plus對熒光圖片進行分析，計算吸光度，吸光度越高，表明細胞內ROS水平越高。以空白對照組的吸光度為基準值(100)，計算每組細胞的ROS相對水平。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 HUVECs 鑒定

vWF因子免疫熒光發(fā)現(xiàn)細胞質激發(fā)出紅色熒光，即呈陽性反應，見圖1。

Figure 1.Red fluorescence was observed in the cytoplasm of HUVECs under fluorescent microscope(×400).圖1 熒光顯微鏡下HUVECs細胞質激發(fā)出紅色熒光

2 Hcy對人臍靜脈內皮細胞MCP－1 mRNA表達的影響

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈濃度依賴性促進人內皮細胞 MCP－1 mRNA表達，Hcy濃度為10－5mol/L時，與空白對照組相比，MCP－1 mRNA表達水平顯著增高(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Effect of Hcy on the mRNA expression of MCP－1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.圖2 Hcy對HUVECs MCP－1 mRNA表達的影響

3 Hcy對人臍靜脈內皮細胞PPARδ mRNA表達的影響

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈濃度依賴性降低人內皮細胞 PPARδ mRNA表達，Hcy濃度為 10－5mol/L時，與空白對照組相比，PPARδ mRNA表達顯著降低 (P＜0.01)，見圖3。

4 GW0742和DPI對Hcy誘導人臍靜脈內皮細胞表達MCP－1 mRNA的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內皮細胞MCP－1 mRNA表達顯著增加(P＜0.01);與Hcy組相比，GW0742組和DPI組人內皮細胞MCP－1 mRNA表達都顯著降低(P＜0.01)，見圖4。

5 GW0742和DPI對Hcy誘導人臍靜脈內皮細胞表達PPARδ mRNA的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內皮細胞PPARδ mRNA表達顯著降低(P＜0.01);與Hcy組相比，DPI組人內皮細胞PPARδ mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義;GW0742組人內皮細胞PPARδ mRNA顯著增高(P ＜0.05)，見圖5。

Figure 3.Effect of Hcy on the mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.圖3 Hcy對HUVECs PPARδ mRNA表達的影響

Figure 4.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of MCP －1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;##P＜0.01 vs Hcy group.圖4 GW0742和DPI對Hcy誘導HUVECs表達MCP－1 mRNA的影響

6 GW0742和DPI對Hcy誘導人臍靜脈內皮細胞表達PPARδ蛋白的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內皮細胞PPARδ蛋白表達顯著降低(P＜0.05);與Hcy組相比，DPI組人內皮細胞PPARδ蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，GW0742組人內皮細胞PPARδ蛋白表達顯著增加(P＜0.05)，見圖6。

Figure 5.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10－3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖5 GW0742和 DPI對 Hcy誘導 HUVECs表達PPARδ mRNA的影響

Figure 6.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced protein expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖6 GW0742和DPI對Hcy誘導HUVECs表達PPARδ蛋白的影響

7 GW0742和DPI對Hcy誘導人臍靜脈內皮細胞產生ROS的影響

與空白對照組相比，Hcy組人內皮細胞ROS熒光信號增強;與Hcy組相比，GW0742組和DPI組人內皮細胞ROS熒光信號減弱，見圖7。

Figure 7.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced production of ROS in HUVECs(×400).Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.圖7 GW0742和DPI對Hcy誘導HUVECs產生ROS的影響

討 論

血漿Hcy的增高和一些代謝紊亂疾病包括動脈粥樣硬化等密切相關。HHcy被認為是AS的一個獨立危險因素。陶碩秋等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Hcy通過NADPH氧化酶介導ROS途徑，促進內皮細胞表達血管細胞黏附分子－1(vascular cell adhesion molecule－1，VCAM－1)而參與AS的發(fā)病過程。MCP－1募集的單核細胞參與AS的起始過程。研究指出，血液中MCP－1增高可增加冠心病人急性心梗和死亡發(fā)生率[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hcy呈濃度依賴性地促進人內皮細胞MCP－1 mRNA表達。Hwang等[13]在高蛋氨酸飼養(yǎng)大鼠發(fā)現(xiàn)，大鼠腎臟MCP－1表達增加，同時腎小球硬化增加。由此可見，Hcy引起的MCP－1表達增高在HHcy引起的AS過程中發(fā)揮重要作用。

動脈粥樣硬化過程中，氧化應激致細胞內ROS表達增高[3]。本實驗還發(fā)現(xiàn)，Hcy在促進人內皮細胞MCP－1 mRNA表達增高的同時還增加了細胞內ROS的釋放，而DPI抑制Hcy促進人內皮細胞MCP－1 mRNA表達和細胞內ROS水平。我們的結果表明，ROS參與Hcy誘導人內皮細胞MCP－1表達的過程。

我們的研究同時還發(fā)現(xiàn)，Hcy可抑制人內皮細胞 PPARδ mRNA 和蛋白的表達。Lee 等[14－15]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠炎癥因子表達增高的同時，而PPARδ表達下降。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活后可以抑制Hcy誘導的人內皮細胞MCP－1 mRNA的表達;Zingarelli等[16]在研究小鼠敗血癥模型時發(fā)現(xiàn)PPARδ表達減弱，而小鼠全身性炎癥因子的釋放增加，這種反應在應用PPARδ激動劑時得到改善。楊大春等[17]在研究心肌梗死重構大鼠模型時發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活后可以通過抑制炎癥因子基質金屬蛋白酶－9表達，從而改善梗死心肌重塑。這表明PPARδ可以通過抑制炎癥因子的表達而發(fā)揮抗炎作用。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，PPARδ激活在抑制Hcy誘導的人內皮細胞MCP－1 mRNA表達的同時，降低細胞內ROS水平，而應用DPI也可抑制Hcy誘導人內皮細胞MCP－1mRNA的表達，提示PPARδ激活可能是通過ROS途徑抑制MCP－1的表達，從而起到抗動脈粥樣硬化作用。而 Fan等[18]研究表明，PPARδ可通過減少細胞內ROS的釋放抗氧化應激機制抑制內皮細胞炎性反應。但其具體作用機制仍需更深入的研究。

總之，我們發(fā)現(xiàn)，Hcy可以誘導人內皮細胞MCP－1 mRNA的表達及ROS的產生，而PPARδ激活后抑制這些作用，其可能是通過NADPH氧化酶介導的ROS途徑發(fā)揮抗炎作用。PPARδ有望成為動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。

[1]Hung MJ，Cherng WJ，Cheng CW，et al.Comparison of serum levels of inflammatory markers in patients with coronary vasospasm without significant fixed coronary artery disease versus patients with stable angina pectoris and acute coronary syndromes with significant fixed coronary artery disease[J].Am J Cardiol，2006，97(10):1429 －1434.

[2]Inoue S，Egashira K，Ni W，et al.Anti－monocyte che-moattractant protein－1 gene therapy limits progression and destabilization of established atherosclerosis in apolipoprotein E － knockout mice[J].Circulation，2002，106(21):2700－2706.

[3]Griendling KK，F(xiàn)itzGerald GA.Oxidative stress and cardiovascular injury.Part I:basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS[J].Circulation，2003 ，108(16):1912－1916.

[4]Park JG，Oh GT.The role of peroxidases in the pathogenesis of atherosclerosis[J].BMB Rep，2011，44(8):497 －505.

[5]Hulsmans M，Holvoet P.The vicious circle between oxidative stress and inflammation in atherosclerosis[J].J Cell Mol Med，2010，14(1 －2):70 －78.

[6]李恒斌，尚士芹.同型半胱氨酸水平與冠心變病患者冠狀動脈病變程度相關性研究[J].中國實驗診斷學，2009，13(9):1258－1259.

[7]Tribouilloy CM，Peltier M，Iannetta Peltier MC，et al.Plasma homocysteine and severity of thoracic aortic atherosclerosis[J].Chest，2000，118(6):1685 － 1689.

[8]Woo CW，Siow YL，O K.Homocysteine induces monocyte chemoattractant protein－1 expression in hepatocytes mediated via activator protein －1 activation[J].J Biol Chem，2008，283(3):1282－1292.

[9]Wang N.PPAR － δ in vascular pathophysiology[J].PPAR Res，2008，2008:164163.

[10]Bishop－Bailey D，Bystrom J.Emerging roles of peroxisome proliferator－ activated receptor－ β/δ in inflammation[J].Pharmacol Ther，2009，124(2):141 －150.

[11]陶碩秋，徐尚華，巢 毅，等.聯(lián)合運用晚期糖基化終產物和同型半胱氨酸誘導人臍靜脈內皮細胞血管細胞黏附因子1 mRNA表達及機制[J].中國動脈硬化雜志，2010，18(1):20 －24.

[12]Lemos JA，Morrow DA，Sabatine MS，et al.Association between plasma levels of monocyte chemoattractant protein－1 and long－term clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes[J].Circulation，2003，107(5):690－695.

[13]Hwang SY，Woo CW，Au－Yeung KK，et al.Homocysteine stimulates monocyte chemoattractant protein－1 expression in the kidney via nuclear factor－ κB activation[J].Am J Physiol Renal Physiol，2008，294(1):F236 －F244.

[14]Lee TI，Kao YH，Chen YC，et al.Cardiac peroxisomeproliferator－activated receptor expression in hypertension co － existing with diabetes[J].Clin Sci(Lond)，2011，121(7):305－312.

[15]Lee TI，Kao YH，Chen YC，et al.Oxidative stress and inflammation modulate peroxisome proliferator－activated receptors with regional discrepancy in diabetic heart[J].Eur J Clin Invest，2010，40(8):692 －699.

[16]Zingarelli B，Piraino G，Hake PW，et al.Peroxisome proliferator－ activated receptor δ regulates inflammation via NF － κB signaling in polymicrobial sepsis[J].Am J Pathol，2010，177(4):1834 －1847.

[17]楊大春，馬雙陶，楊永健，等.激活PPARδ對梗死心肌MMP－9及纖連蛋白表達的影響[J].中國病理生理雜志，2010，26(11):2130 －2135.

[18]Fan Y，Wang Y，Tang Z，et al.Suppression of pro－inflammatory adhesion molecules by PPAR－δ in human vascular endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(2):315 －321.