邢衛(wèi)杰， 蔡柳洪， 李 予， 王文軍， 麥美琪， 楊冬梓， 張清學△

(1中山大學附屬第三醫(yī)院不育與性醫(yī)學科，廣東廣州510630;2中山大學附屬第二醫(yī)院生殖中心，廣東廣州510120)

隨著醫(yī)學技術的進步，許多腫瘤、嚴重血液病或者自身免疫性疾病得到了治愈，但是女性的卵巢功能卻由于化學或物理治療而遭到嚴重損害或衰竭，這使得卵巢功能的保護和生育能力的保存越來越受到重視[1]。目前研究最多的是卵巢組織冷凍保存與移植。盡管有很多實驗表明，移植后的卵巢可以在宿主動物體內(nèi)生存并且有卵泡生長發(fā)育，但是還有許多問題有待解決，比如:缺血再灌注損傷，它是移植后卵巢組織存活最大的威脅[2]。為探索減輕缺血再灌注損傷的方法，本實驗在大鼠卵巢組織自體移植中使用血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，初步探討其在卵巢組織自體移植中的應用價值。

材料和方法

1 動物及分組

健康成熟未交配過的清潔級雌性Sprague－Dawley(SD)大鼠，鼠齡70～80 d，體重190 ～220 g。給予標準光照(14 h光照、10 h黑夜)、室內(nèi)溫度(20±2)℃、濕度40% ～50%、標準飼料和水，飼養(yǎng)1周后開始實驗。20只大鼠隨機分為2組:新鮮卵巢移植組(A組):10只，去勢后自體異位移植新鮮卵巢組織;新鮮卵巢移植加VEGF組(B組):10只，去勢后自體異位移植新鮮卵巢組織，在移植前放入含0.1 μg VEGF(DSL)的5 mL PBS中浸泡5 min，而且移植手術后第1 d開始在移植物局部注射VEGF 0.2 μg，連用5 d。

2 方法

SD大鼠麻醉成功后固定，腹部剪毛，依次使用Ⅲ型安爾碘和75%乙醇消毒腹部皮膚，鋪消毒洞巾。取下腹恥骨聯(lián)合上1 cm做縱形切口，切口長約2～3 cm，進入腹腔。依次找出子宮、雙側輸卵管和卵巢，暴露雙側卵巢，小心切除雙側卵巢及部分輸卵管組織，結扎殘端并充分止血。將獲得的卵巢組織立即放入備好的PBS緩沖液中(B組獲得的卵巢組織放入含0.1 μg VEGF的5 mL PBS中，在常溫下浸泡5 min)，在解剖顯微鏡下去除多余的脂肪組織、結締組織和部分輸卵管，游離出卵巢組織。用眼科剪把卵巢組織剪成約1 mm×1 mm×2 mm大小的組織塊，部分置于10%甲醛固定以備做病理切片，部分做新鮮移植，移植時將處理好的新鮮卵巢組織包埋于腹部切口兩側的皮下與肌層之間，然后75%乙醇消毒皮膚，以絲線間斷縫合關腹。術后3 d使用青霉素肌肉注射抗感染。

3 觀察指標

3.1 SD大鼠的動情周期 各組SD大鼠自卵巢移植后，每日上午行陰道脫落細胞涂片，用小棉簽蘸生理鹽水涂陰道脫落細胞于載玻片上，晾干后用堿性美蘭液(美蘭3.0 g、95%乙醇30 mL、10%氫氧化鈉0.1 mL和蒸餾水100 mL)中浸泡5 min，用清水沖洗后晾干，在普通光學顯微鏡下觀察，根據(jù)角化細胞的比例來了解動情周期的情況[2]。

3.2 組織形態(tài)學 SD大鼠行卵巢組織移植后飼養(yǎng)4周。麻醉后切開腹部皮膚，觀察移植的卵巢組織的生長發(fā)育情況及周圍血供情況，并完整剝離移植物，放入10%甲醛液中保存，以作病理切片行組織學檢查。

各級卵泡的形態(tài)學表現(xiàn)是[3]:始基卵泡:單層梭形前顆粒細胞包繞1個處于減數(shù)分裂雙線期的初級卵母細胞;初級卵泡:1層立方形顆粒細胞包繞卵母細胞;次級卵泡:2層或2層以上的立方形的顆粒細胞包繞卵母細胞;竇卵泡:有多層顆粒細胞包繞卵母細胞，并有卵泡腔的形成。按 Gougeon[4]的標準，形態(tài)學正常的卵泡表現(xiàn)為:完整的卵母細胞，內(nèi)見圓形細胞核及清晰的核仁，周圍包繞的顆粒細胞排列規(guī)則，核無濃縮。形態(tài)學異常的卵泡表現(xiàn)為:卵泡結構不完整或消失，卵母細胞皺縮，卵母細胞核固縮，顆粒細胞排列紊亂。

3.3 血清中的雌二醇水平 SD大鼠行卵巢組織移植后，飼養(yǎng)4周。在取卵巢組織的同時取下腔靜脈血約3 mL，用低溫離心機3 000 r/min離心10 min，血清用放免試劑盒(DSL)測雌二醇水平。

4 統(tǒng)計學處理

結 果

實驗過程中共有5只大鼠因麻醉意外、感染等死亡，其中A組3只、B組2只。

1 動情周期的恢復率

A組7只SD大鼠中共有6只恢復動情周期，動情周期恢復率為85.7%，有1只大鼠雖沒有恢復動情周期，但是從其陰道脫落細胞涂片分析，角化細胞比例＞50%，可以視為受雌激素影響，在一定程度上，可以認為已經(jīng)恢復卵巢功能;B組中8只SD大鼠全部恢復動情周期，動情周期恢復率為100%。

2 移植4周后SD大鼠卵巢組織的大體標本觀察

2.1 A組 移植4周后取標本時，移植物體積比移植前明顯增大，移植前卵巢組織平均體積為(1.36±0.61)mm3，4 周后移植物平均體積為(13.30 ±7.19)mm3。移植物與周圍組織邊界清晰，表面可見細小的血管從周圍組織中長入卵巢組織中。體積計算公式為:長 × 寬 × 高 ×0.52。

2.2 B組 移植4周后取標本時，移植物體積比移植前明顯增大，移植前卵巢組織平均體積為(1.46±0.49)mm3，4 周后移植物平均體積為(40.04 ±30.46)mm3。移植物表面布滿細小的血管，呈鮮紅色，從表面偶可見到透明狀囊性小卵泡，周圍組織血供豐富。

比較移植前后的卵巢組織體積以及A組和B組移植后的卵巢組織體積大小，發(fā)現(xiàn)體積大小的差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 卵巢組織移植前后的體積比較Table 1.The comparison of ovarian size in the two groups before and after transplantation(±s)

表1 卵巢組織移植前后的體積比較Table 1.The comparison of ovarian size in the two groups before and after transplantation(±s)

*P ＜0.05 vs group A.

Group n Before transplantation(mm3)After transplantation(mm3)A 7 1.36 ±0.61 13.30 ±7.19 B 8 1.46 ±0.49 40.04 ±30.46*

3 新鮮卵巢組織移植后4周的形態(tài)學觀察

光鏡下:A組和B組中，均可見到正常形態(tài)的始基卵泡和生長卵泡(初級卵泡、次級卵泡、竇前卵泡和竇卵泡)。形態(tài)學正常的卵泡均有完整的卵母細胞，內(nèi)見圓形的細胞核及清晰的核仁，周圍包繞的顆粒細胞排列規(guī)則，核無濃縮。偶可見到異常形態(tài)的卵泡，見圖1。

每個標本觀察10個高倍鏡視野，對各級卵泡進行計數(shù)，最后分別計算出各組中形態(tài)正常的卵泡所占比例，見表2。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)各級正常形態(tài)卵泡所占的比例在2組之間的差異均沒有統(tǒng)計學意義，但是從表2可以看出，B組中移植后正常形態(tài)的竇卵泡所占比例與A組移植后相比有增高趨勢。

Figure 1.Normal follicles in the two groups(×400).A:primordial follicles，with one layer of flattened granulosa cells around the oocyte(group A);B:primary follicles，with one layer of cuboidal granulosa cells around the oocyte(group A);C:secondary follicles，with two or more layers of cuboidal granulosa cells around the oocyte(group B);D:antral follicles，with an antral cavity formed as a result of coalescence of the fluidfilled spaces(group A).圖1 2組中形態(tài)正常的卵泡

表2 2組正常形態(tài)卵泡所占比例Table 2.The proportion of normal follicles in the two groups(%.±s)

表2 2組正常形態(tài)卵泡所占比例Table 2.The proportion of normal follicles in the two groups(%.±s)

Classification of follicles Group A(n=7)Group B(n=8)Before transplantation After transplantation Before transplantation After transplantation Primordial follicle 91.42 ±8.66 82.14 ±23.7886.76 ±17.74 82.29 ±20.14 Primary follicle 86.43 ±24.58 80.95 ±24.40 78.75 ±24.75 81.21 ±12.82 Secondary follicle 91.45 ±10.97 84.49 ±20.54 90.63 ±18.60 81.73 ±16.06 Antral follicle 98.21 ±4.72 79.29 ±17.84 96.88 ±8.84 80.21 ±18.86

4 卵巢組織移植4周后血清雌二醇的測定結果

A組雌二醇平均水平為 (6.64±2.53)ng/L;B組雌二醇平均水平為(10.70±3.10)ng/L，2組的雌二醇水平差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

討 論

1 缺血再灌注損傷對卵巢組織移植的影響

卵巢組織移植過程中的卵泡丟失與移植物局部缺血缺氧的持續(xù)時間，即血管長入移植物所用的時間有關，受血管生長因子的調節(jié)。有學者認為:缺血再灌注損傷是移植后卵巢組織存活的最大威脅，由于存在缺血再灌注損傷，移植后卵巢組織的體積比移植前縮小30%～70%，并且卵巢組織出現(xiàn)明顯的纖維化，嚴重影響卵泡的生長發(fā)育及卵巢功能的恢復。有研究表明竇前卵泡死亡主要是由于缺血再灌注損傷造成，而不是由于冷凍損傷本身[5]。因此，怎樣有利于血管生成以及避免缺血再灌注損傷成為移植中的關鍵問題。

2 VEGF的生理作用

為了找出減少缺血再灌注損傷的方法，有學者對此進行了一些研究。Schnorr等[6]用猴子做實驗，卵巢自體移植后應用VEGF，結果顯示實驗組與對照組中卵巢功能恢復的比例沒有顯著差別，但是在卵巢功能恢復的猴子中，使用VEGF的猴子體內(nèi)激素水平比不使用VEGF的激素水平顯著升高，說明VEGF對促進移植后卵巢功能的恢復有一定的作用。VEGF是高度特異性的血管內(nèi)皮細胞生長因子，是血管生成開關的主要成分，它作用最強大，可能是最初起始血管生成一系列反應的信號因子，具有以下幾種功能:(1)促進內(nèi)皮細胞的增殖;(2)增加微血管通透性;(3)改變細胞外基質;(4)維持血管生成等作用。動物實驗表明:VEGF及轉化生長因子－β1(TGF－β1)等的存在有助于提高血管長入的速度，促性腺激素可調節(jié)卵巢內(nèi)血管生長因子水平，從而可以促進血管生成[7]。

3 VEGF對移植卵巢組織的作用

在大鼠卵巢組織移植實驗的研究中發(fā)現(xiàn)，血管重建一般發(fā)生于移植后的48 h內(nèi)，需要的時間超過24 h，約有50%的始基卵泡由于缺血再灌注損傷而丟失[8]。另外有實驗發(fā)現(xiàn):VEGF是在移植后早期(48 h內(nèi))對血管重建起關鍵作用，血管生長因子(如:VEGF、TGF等)的合成應在移植前達到有效濃度，并維持一定時間，以誘導新血管形成，減輕局部缺血缺氧的發(fā)生[7]。根據(jù)以上理論基礎，而且依據(jù)Schnorr等[6]的實驗中應用的VEGF濃度，本實驗中B組中大鼠的卵巢組織，在移植之前放入含有0.1 μg VEGF的5 mL PBS中浸泡，使其充分接觸VEGF，使VEGF在移植前達到有效濃度，而術后繼續(xù)局部注射VEGF使之維持在一定的濃度，以減少血管重建所需時間，進而減輕由于缺血時間過長而造成的卵泡丟失和卵巢組織的損傷。本實驗結果發(fā)現(xiàn):B組中SD大鼠的雌二醇水平明顯高于A組;A組和B組移植后的卵巢體積明顯大于移植前的卵巢體積，且B組移植后的卵巢體積明顯大于A組，其差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。此外，B組中移植后正常形態(tài)的竇卵泡所占比例與A組移植后相比有增高趨勢。肉眼觀察移植物，發(fā)現(xiàn)B組中的移植物表面布滿細小的新生血管，且B組中移植物周圍組織血供豐富，有許多小血管從周圍組織中長入移植物中。

本實驗結果證明，在卵巢組織移植過程中使用VEGF，可以減少因缺血再灌注而造成對卵巢組織的損傷，可以在一定程度上促進卵巢組織功能的恢復。在以后的實驗中可以根據(jù)不同濃度梯度進行分組，以找到VEGF的最佳濃度，使之發(fā)揮更好的促進血管重建的作用。

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