吳惠文，韓德五，許瑞齡，周 鑫，王 鋒，趙元昌

(山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山西 太原 030001)

過多果糖(fructose，F(xiàn)ru)攝入引起肥胖、高血壓、血脂代謝異常、2 型糖尿病等代謝性疾?。?－3］。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)作為諸多代謝性疾病發(fā)病的“共同土壤”，與認知功能損害或阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)關(guān)系密切［4－5］。甚至有學(xué)者提出AD本身就是“腦的胰島素抵抗狀態(tài)”或“3型糖尿病”的觀點［6］。脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是體內(nèi)觸發(fā)免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥級聯(lián)反應(yīng)最重要的因素，可參與多種代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展［7］。我室長期致力于研究腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia，IETM)在疾病損傷中的作用，并發(fā)現(xiàn)甘氨酸(glycine，Gly)可減輕多種肝損傷導(dǎo)致的IETM［8－9］。為此，我們擬觀測甘氨酸是否可通過減輕IETM改善高果糖飲食誘導(dǎo)的IR和認知功能損害。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high－density lipoprotein cholesterol，HDL－C)和總膽固醇(total cholesterol，TC)試劑盒購自中生北控公司;胰島素、TNF－α、IL－6 ELISA試劑盒購自R＆D;LPS試劑盒購自廈門鱟試劑實驗廠;游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)試劑盒購自南京建成公司;胰島素受體β亞單位(insulin receptor β subunit，IRβ)、磷脂酰肌醇3－ 激酶 α 亞單位(phosphatidylinositol 3 － kinase α subunit，PI3Kα)抗體購自 Cell Signaling Technology;磷酸化的IRβTyr1162/1163和 PI3KαTyr508抗體購自 Santa Cruz。

1.2 動物 清潔級雄性SD大鼠32只，體重230～240 g，購自山西醫(yī)科大學(xué)動物中心。

2 動物分組及處理

大鼠隨機分為4組，每組8只;對照組(control)，飲用自來水;果糖模型組(Fru組)，飲用含8% 果糖的自來水;干預(yù)組(Fru+Gly組)，飲用含8%果糖+1% 甘氨酸的自來水;甘氨酸組(Gly組)，飲用含1% 甘氨酸的自來水。大鼠自由飲水、進食(標準大鼠飼料)，每月測量體重及收縮壓。8個月末，在結(jié)束口服糖耐量試驗及認知功能測試后，12 h禁食，1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈取血并分離血漿，迅速分離大腦皮層，－80℃冷凍保存。

3 檢測指標和方法

3.1 血漿指標檢測 按試劑盒說明書分別測定血漿葡萄糖、TG、HDL － C、TC、FFA、胰島素、LPS。計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of IR，HOMA－IR)，公式為:空腹血糖 (mmol/L)×空腹胰島素 (103EU/L)/22.5。

3.2 口服糖耐量試驗 12 h禁食，以50%的葡萄糖溶液灌胃(1.5 g/kg)，分別于灌胃前(0 min)、灌胃后(15 min、30 min、120 min)尾靜脈采血，采用血糖儀(羅氏活力型)檢測血糖。

3.3 促炎因子檢測 血漿及腦組織(10%腦皮層勻漿)TNF－α和IL－6的檢測采用ELISA試劑盒并按照說明書操作進行。

3.4 Western blotting檢測 IRβ、PI3Kα 及其磷酸化蛋白表達 取凍存皮層組織，分別置于玻璃勻漿器中加入1 mL組織裂解液在冰浴中反復(fù)研磨，裂解30 min，4℃ 12000 r/min離心20 min，取上清液 BCA法定量，調(diào)整各上樣量 40 μL/well，7.5%SDS 聚丙乙烯酰胺凝電泳，4℃ PVDF轉(zhuǎn)膜過夜，5%(W/V)脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別與目的抗體(IRβ和PI3Kα 抗體，1∶1000 稀釋;磷酸化蛋白抗體，1∶750稀釋)4℃雜交過夜，洗滌后，加入辣根過氧化酶標記的Ⅱ抗，室溫孵育2 h，洗滌、曝光、顯影，采用Quantity One(Bio－Rad Laboratories)對膠片進行灰度分析。

3.5 Morris水迷宮測試認知功能 Morris水迷宮系統(tǒng)由水迷宮裝置、圖像采集處理系統(tǒng)(Ethovision 3.0)組成。測試用的圓形水池直徑150 cm，高30 cm，由內(nèi)部涂抹成黑色油漆的不銹鋼材料制作而成。水池內(nèi)水的高度30 cm，水溫保持在24～26℃。黑色的逃避平臺直徑14 cm，低于水面1.5 cm并放置于水池其中一個象限的中央。攝像機位于水池上方，記錄大鼠游泳軌跡與時間。Morris水迷宮實驗由3部分組成。其中，平臺逃避實驗連續(xù)持續(xù)5 d，每天上午、下午各進行2次。每次實驗將大鼠面對池壁放入水池任何一象限中央，讓其自由游泳尋找平臺。當大鼠爬上平臺時，讓其在平臺停留20 s，再進行下次實驗。如果在120 s內(nèi)，大鼠沒有找到平臺，則用手指引大鼠爬上平臺，仍然讓其在平臺上停留20 s。實驗中，大鼠到達平臺的時間即為逃避潛伏期(escape latency)?？臻g探索實驗在平臺逃避實驗結(jié)束后第6 d進行。實驗前，移去水池內(nèi)平臺，用相同方法置大鼠與水池中，120 s內(nèi)讓大鼠自由游泳尋找平臺，以測試大鼠空間記憶效果，主要記錄大鼠在水池內(nèi)不同象限游泳所花費的時間與距離。最后，實驗主要測試大鼠游泳速度及視力水平。實驗前，平臺仍被放置到水池原先位置并高于水面1.5 cm，重復(fù)平臺逃避實驗3次，主要記錄逃避潛伏期與游泳速度。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 大鼠一般狀況

實驗期間，所有大鼠狀況良好。模型組大鼠體重增長在第3～6月明顯高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，甘氨酸在第4月、第6月顯著降低模型組體重增長(P＜0.05)，見圖1A。模型組與對照組比較，第3月后收縮壓明顯升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，甘氨酸在第4～6月顯著降低模型組收縮壓的升高(P＜0.05，P ＜0.01)，見圖1B。

2 血糖、血脂代謝變化

與對照組比較，模型組血糖、TG、TC、HDL－C和FFA水平顯著升高(P＜0.01);干預(yù)組與模型組比較，血糖、TG及 FFA 顯著降低(P ＜0.05，P ＜0.01)，但TC和HDL－C變化無顯著差異，見表1。

Figure 1.Effects of glycine(Gly)on monthly body weight gain and systolic blood pressure in high－fructose(Fru)diet rats.E.n=8.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.圖1 甘氨酸對高果糖飲食大鼠每月體重增長與收縮壓變化的影響

表1 甘氨酸對高果糖飲食大鼠血糖及血脂的影響Table 1.Effects of glycine on plasma glucose and lipid profiles in high－fructose diet rats(mmol/L.E.n=8)

表1 甘氨酸對高果糖飲食大鼠血糖及血脂的影響Table 1.Effects of glycine on plasma glucose and lipid profiles in high－fructose diet rats(mmol/L.E.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.

Group Glucose TG TC HDL－C FFA Control 4.58 ±0.24 0.31 ±0.02 1.16 ±0.07 1.26 ±0.05 0.39 ±0.04 Fru 8.84 ±0.52＊＊ 0.44 ±0.04＊＊ 1.77 ±0.10＊＊ 0.88 ±0.07＊＊ 0.85 ±0.03＊＊Fru+Gly 7.60 ±0.34# 0.34 ±0.02## 1.70 ±0.03 0.85 ±0.04 0.51 ±0.06##Gly 4.51 ±0.20 0.30 ±0.02 1.07 ±0.04 1.06 ±0.050.35 ±0.02

3 糖耐量實驗結(jié)果

甘氨酸組各時點血糖與對照組比較，沒有顯著差異;模型組各時點血糖顯著高于對照組(P＜0.01);與模型組比較，干預(yù)組各時點血糖顯著降低(P＜0.05，P ＜0.01)，見圖2。

4 血漿胰島素、LPS與HOMA－IR變化

模型組血漿胰島素、LPS及HOMA－IR顯著高于對照組(P＜0.01);干預(yù)組上述指標顯著低于模型組(P ＜0.01)，見表2。

5 血漿LPS與HOMA－IR及FFA的相關(guān)性

血漿 LPS與 HOMA －IR(rs=0.75，P ＜0.01)及FFA(rs=0.62，P ＜0.01)呈顯著正相關(guān)。

6 血漿及腦組織TNF－α、IL－6變化

模型組血漿及腦組織TNF－α、IL－6水平明顯高于對照組(P＜0.01);干預(yù)組與模型組比較，上述指標明顯降低(P ＜0.01，P ＜0.05)，見表3。

7 Western bloting結(jié)果

模型組皮層IRβ表達與對照組相比大約升高了2倍(P ＜0.01)，但 p－IRβTyr1162/1163/IRβ 及 p－PI3KαTyr508/PI3Kα比值則顯著降低(P＜0.01);甘氨酸顯著降低模型組IRβ的表達(P＜0.05)，顯著提高2種蛋白表達的比值(P＜0.01);對照組與甘氨酸組蛋白表達無顯著差異，見圖3A、B。

Figure 2.Effects of glycine on oral glucose tolerance test in high－fructose diet rats.E.n=8.＊＊P＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.圖2 甘氨酸對高果糖飲食大鼠口服糖耐量試驗的影響

表2 甘氨酸對高果糖飲食大鼠血漿胰島素、LPS及HOMA－IR的影響Table 2.Effects of glycine on plasma insulin，LPS and HOMA －IR in high－fructose diet rats(E.n=8)

表2 甘氨酸對高果糖飲食大鼠血漿胰島素、LPS及HOMA－IR的影響Table 2.Effects of glycine on plasma insulin，LPS and HOMA －IR in high－fructose diet rats(E.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs Fru group.

Group Insulin(mU/L) Endotoxin(103EU/L)HOMA－IR Control 23.67±1.04 0.07±0.01 4.79±0.26 Fru 43.99±1.33＊＊ 0.17±0.02＊＊ 16.74±1.07＊＊Fru+Gly 37.70±1.65## 0.11±0.01## 13.37±0.57##Gly 22.66±0.89 0.07±0.01 4.56±0.31

表3 甘氨酸對高果糖飲食大鼠血漿及腦組織促炎因子的影響Table 3.Effects of glycine on pro－inflammatory cytokines in plasma and brain tissues in high－fructose diet rats(E.n=8)

表3 甘氨酸對高果糖飲食大鼠血漿及腦組織促炎因子的影響Table 3.Effects of glycine on pro－inflammatory cytokines in plasma and brain tissues in high－fructose diet rats(E.n=8)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01 vs Fru group.

Plasma Brain tissue TNF－α(μg/L)IL－6(ng/L)TNF－α (μg/L) IL－6(ng/L)Control 1.17±0.06 30.97±1.93 3.50±0.15 70.8 Group 438±5.65 Fru 1.74±0.06＊＊ 50.64±0.04＊＊ 4.78±0.20＊＊ 104.96±7.50＊＊Fru+Gly 1.46±0.05## 43.04±1.45# 4.18±0.20# 86.11±4.53##Gly 1.11±0.05 30.26±0.76 3.41±0.14 76.20±3.

8 Morris水迷宮結(jié)果

隨著測試天數(shù)的增加，大鼠平均逃避潛伏期從93.49 s下降到 26.95 s。在測試的第 1 d，4 組大鼠平均逃避潛伏期沒有統(tǒng)計學(xué)差異;從第2 d起，模型組平均逃避潛伏期明顯長于對照組(P＜0.01);干預(yù)組與模型組比較，第4 d、5 d平均逃避潛伏期明顯縮短(P＜0.05);對照組和甘氨酸組平均逃避潛伏期無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖4A、B?？臻g探索實驗結(jié)果顯示，模型組在目標象限所占時間與總時間的百分比顯著低于對照組(P＜0.01);干預(yù)組與模型組比較，該百分比顯著升高(P＜0.05);對照組和甘氨酸組無顯著差異，見圖4C。測試大鼠游泳速度及視力實驗結(jié)果表明，各組大鼠游泳速度(約14.5 cm/s)和可見平臺逃避潛伏期(約14.2 s)無顯著差異。

討 論

食物中普遍添加蔗糖及果糖，是現(xiàn)代社會飲食的一個特點。大量研究表明，果糖過多攝入可引起肥胖、高血壓、2 型糖尿病等代謝性疾病［1－3］。IR 作為代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)發(fā)病的共同病理機制參與了多種代謝性疾病的發(fā)生。本實驗通過長期(8個月)高果糖飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠發(fā)生與人類相似的MS，如肥胖、高血壓、血脂代謝紊亂、糖耐量異常、HOMA－IR升高等。果糖吸收后，經(jīng)門脈進入肝臟，其代謝可繞過糖酵解限速酶－磷酸果糖激酶的調(diào)控，在果糖激酶作用下迅速轉(zhuǎn)為1－磷酸果糖，后者經(jīng)糖酵解或糖異生途徑進一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖、糖原及TG。故高果糖飲食可引起肝臟TG聚集和FFA生成增加，引起肝臟對胰島素敏感性下降和高胰島素血癥形成。

近年來研究表明，MS往往伴有全身輕度炎癥反應(yīng)，提示這種慢性亞臨床炎癥可能參與MS發(fā)?。?0］。LPS是促發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)最重要的因子，其結(jié)合Toll樣受體4(Toll－like receptor 4，TLR4)受體通過IKK/NF－кB通路可導(dǎo)致促炎因子釋放。多種肝損傷模型均伴有IETM，其通過啟動炎癥機制參與多種肝病的發(fā)生、發(fā)展［8－9，11］。Cani等［7］研究也證實，高脂飲食伴有的代謝性內(nèi)毒素血癥可啟動大鼠發(fā)生肥胖及糖尿病。而敲除了TLR4基因可有效保護NF－κB介導(dǎo)的炎癥和IR［12］。甘氨酸是機體一種非必需氨基酸，可降低多種肝損傷所伴的IETM［8－9］。本實驗結(jié)果顯示，長期高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生MS時伴有IETM、輕度炎癥及IR;甘氨酸能減輕模型組IETM、炎癥及IR，并改善MS(如肥胖、高血壓、血脂異常等)。本實驗大鼠血漿LPS水平與IR高度相關(guān)提示，IETM可能是果糖飲食致外周IR發(fā)生的重要因素。LPS引起外周IR可能涉及的機制有:(1)LPS與TLR4受體結(jié)合通過IKK/NF－κB通路，釋放大量的促炎因子(TNF－α、IL－6等)引起胰島素受體底物酪氨酸磷酸化，誘發(fā)IR。(2)LPS可直接刺激脂肪分解為FFA，其通過TLR4受體介導(dǎo)，引起脂肪細胞、巨噬細胞及肝臟枯否細胞釋放促炎因子，促發(fā)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，引起IR［12－13］。本實驗結(jié)果也顯示，模型組大鼠血漿FFA水平顯著升高，并且與血漿LPS水平正相關(guān)。(3)LPS還可通過激活巨噬細胞產(chǎn)生活性氧自由基參與IR的發(fā)生［14］。

Figure 3.Effects of glycine on the expression of IRβ，p－IRβTyr1162/1163，PI3K α and p－PI3KαTyr508in the cerebral cortex in highfructose diet rats.A:relative densitometric values of IRβ/β－actin(left panel)and p－IRβTyr1162/1163/IRβ (right panel);B:relative densitometric values of PI3Kα/β－actin(left panel)and p－PI3KαTyr508/PI3Kα(right panel).E.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs Fru group.圖3 甘氨酸對高果糖飲食大鼠大腦皮層IRβ、p－IRβTyr1162/1163、PI3Kα及p－PI3KαTyr508蛋白表達的影響

Figure 4.Effects of glycine on the results of Morris water maze test in high－fructose diet rats.A:the results of the escape latency test in different groups;B:original swimming traces of the rats in different groups in the hidden platform acquisition on the 4th day;C:the percentage of time spent in the target quadrant in different groups.E.n=8.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs Fru group.圖4 甘氨酸對高果糖飲食大鼠Morris水迷宮實驗的影響

越來越多研究資料表明，MS與認知功能損害或者 AD 關(guān)系密切［4－5］。Yaffe 等［4］對 2632 名 MS 患者調(diào)查結(jié)果表明，MS是認知功能下降的高危險因素。近年來研究認為，胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)腦內(nèi)糖代謝中發(fā)揮重要作用，進而對神經(jīng)發(fā)育和學(xué)習(xí)、記憶產(chǎn)生影響［15］。Ho 等［16］發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生中樞IR，其與學(xué)習(xí)、記憶功能損害密切相關(guān)。本研究顯示，長期高果糖飲食既引起大鼠發(fā)生MS，也引起認知功能發(fā)生損害。盡管MS與認知功能損害之間的機制尚未完全闡明，但普遍認為IR發(fā)揮著重要作用。IRβ和PI3K是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白，其功能減弱是形成IR的重要分子基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，長期高果糖飲食不僅誘導(dǎo)大鼠發(fā)生外周IR和炎癥反應(yīng)，同時中樞也出現(xiàn)明顯的 IR(p－IRβTyr1162/1163/IRβ 和 p －PI3KαTyr508/PI3Kα 比值降低)和炎癥反應(yīng);甘氨酸通過降低IETM可改善模型組中樞IR、炎癥和認知功能。以上結(jié)果提示，中樞IR及炎癥在模型組大鼠認知功能障礙發(fā)生中可能起關(guān)鍵作用。模型組大鼠發(fā)生中樞IR或認知功能損害可能的原因有:(1)外周炎癥因子通過活化腦血管內(nèi)皮細胞進入腦內(nèi)，可引起中樞炎癥反應(yīng)，進而影響認知功能［17］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，甘氨酸通過降低IETM可顯著降低外周與中樞的促炎因子水平。(2)慢性高胰島素血癥通過下調(diào)血腦屏障胰島素受體，減少胰島素轉(zhuǎn)運進入腦，也可促進中樞 IR的發(fā)生［18］。(3)外周少量LPS在其受體介導(dǎo)下可進入腦，進而激活小膠質(zhì)細胞釋放促炎因子，促進中樞 IR的發(fā)生［19－20］。在實驗中我們還發(fā)現(xiàn)，甘氨酸對高果糖飲食誘導(dǎo)的早期血壓升高具有改善作用(待發(fā)表)。

綜上所述，在長期高果糖飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生外周及中樞IR中IETM發(fā)揮著重要作用。甘氨酸通過降低IETM可減輕外周與中樞炎癥和IR，進而改善高果糖飲食誘導(dǎo)的MS和認知功能障礙。

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